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記事ID : 2742
研究用

IP抗体のH鎖とL鎖を検出せずに、目的タンパク質のバンドのみを検出!ImmunoCruz™ 免疫沈降/ウェスタンブロット検出システム

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免疫沈降(IP)で得られたタンパク質をウェスタンブロット(WB)で検出する際、IP用抗体のH鎖とL鎖に対するバンドを効果的に除去し、目的タンパク質のバンドのみを検出します。

特長

免疫沈降(IP)で得られたタンパク質をウェスタンブロット(WB)で検出する際、IP用抗体のH鎖とL鎖に対するバンドを効果的に除去するための試薬です。IP用及びWB用にヤギ、マウス、ウサギ等の抗体の組み合わせにも対応するよう、6種類の検出システムを取り揃えています。

各キットには、目的の抗原抗体複合体を沈殿させるために必須のIPマトリクスと、目的のWB用抗体のみを検出するためのHRP標識試薬が含まれています。

目的のバンドがIP抗体のH鎖もしくはL鎖に近い場合や、発現レベルが低いために通常のウェスタンブロットでは検出困難な細胞内タンパク質を検出する際に、特におすすめします。

構成内容

  • 免疫沈降マトリクス(25% v/v)(2.0ml )
  • WB用HRP標識プローブ(200µg)
    希釈倍率は1:1,000〜1:10,000を目安にご使用ください。

プロトコール

使用方法概略

SCB_01290001_F-20-170-10K_01.jpg

)IPマトリックスの抗体との結合部位は、FCフラグメントに限りません。

 

プロトコール

  1. 全細胞溶解液の調製
  2. 全細胞溶解液の前(preclear)処理(必要に応じて)
    1.5mLマイクロ遠心チューブを用いて、約1mLの全細胞溶解液もしくは組織抽出物あたり、各キットに含まれるIPマトリックス(suspended, 25% v/v)を40〜50μL添加します。4℃で回転させながら、30分間インキュベートします。
    ※Ig発現細胞(脾臓細胞もしくは培養B細胞等)からライセートを調製した場合は、内因性のIgを完全に除去するために、プロテインA/Gを用いた事前の精製を、2〜3回行ってください。
  3. 4℃、最大速度で、30秒間遠心分離を行い、IPマトリックスペレットを得ます。ペレットを乱さないように、目的とする上清(precleared cell lysate)を新しいチューブに移し、氷上に置きます。ペレットは廃棄してください。
  4. IP抗体-IPマトリックス複合体の作製
    マイクロチューブにIPマトリックス(suspended, 25% v/v)を40〜50μL添加し、IP抗体を1〜5μgとPBSを500μL加えます(抗体の最適量は、お客様自身で決定してください)。4℃で回転させながら、少なくとも1時間インキュベートします。この操作は、上記2のpreclearステップと同時に行うことができます。また、実験日よりも前に行うことも可能です。インキュベートは、4℃で一晩でも問題ありません。
    ※IP抗体の種特異性は、各キットに含まれるIPマトリックスの種特異性とマッチさせてください。マウス抗体でIPを行う場合は、マウスIPマトリックスを含むキット(品番sc-45040もしくはsc-45042)を使用します。
  5. 種特異的IPマトリックスとIP抗体をインキュベートした後、4℃、最大速度で、30秒間遠心分離を行い、マトリックスペレットを得ます。慎重に吸引を行って、上清は廃棄してください。
  6. マトリックスペレットを500μLのPBSで洗浄し、ステップ5と同様に遠心分離、吸引、上清廃棄の操作を2回繰り返します。
  7. 免疫沈降(IP)
    IP抗体-IPマトリックス複合体の最後の洗浄後、溶解液を移して、4℃で回転させながら1時間から一晩、インキュベートします。
  8. インキュベート後、4℃、最大速度で、30秒間遠心分離を行うことにより、ペレットを得ます。上清は吸引して廃棄するか、別のIP用もしくはWB用に保管しておきます。
  9. マトリックスペレットを、RIPA溶解バッファー(品番sc-24948,※推奨)もしくは1×PBSで洗浄し、遠心分離後、上清を吸引するという操作を、2〜4回繰り返します。
  10. 最後の洗浄後、上清を吸引して廃棄し、還元型の2×電気泳動サンプルバッファー(品番sc-24945)40〜50μLでペレットを再懸濁します。その後、サンプルを2〜3分間ボイルしてください。
    ※ImmunoCruz™を適切に作用させるため、IPサンプルは、完全に還元・変性させる必要があります。
  11. クイックスピンでIPマトリックスペレットを沈殿させ、慎重に、上清をゲル上にロードして、電気泳動を行います。
  12. この際、イムノブロット(一次)抗体は、各キット内のHRP標識ImmunoCruz™検出試薬の種特異性にマッチさせる必要があります。対応するHRP標識ImmunoCruz™試薬と、ウェスタンブロットルミノール試薬(品番sc-2048)を用いて、イムノブロット(一次)抗体を検出してください。

※ImmunoCruz™ E(品番sc-45042)を使用する際には、次に述べるような、特別な方法でWBを行ってください。

ImmunoCruz™ E(品番sc-45042)用WBプロトコール

  1. 転写後、メンブレンをTBST(10×, 品番sc-24953)で1時間ブロッキング/洗浄します。インキュベートの途中で1回、TBSTを交換してください。
  2. ImmunoCruz™ E希釈バッファーでWB抗体を希釈し、メンブレンに添加して室温で1〜2時間インキュベートします。
  3. インキュベート後、メンブレンを1×TBSTバッファーで5分間、3回洗浄します。
  4. ImmunoCruz™ E希釈バッファーで、ImmunoCruz™ E WB試薬を希釈し(1:1000〜1:10000)、メンブレンに添加して室温で1〜2時間インキュベーションします。
  5. インキュベート後、メンブレンを1×TBSTバッファーで5分間、3回洗浄します。
  6. その後、メンブレンを1×TBS(10×, 品番sc-24951)で5分間、1回洗浄します。
  7. WB ルミノール試薬(品番sc-2048)とメンブレンをインキュベートし、シグナルを検出します。

使用例

SCB_01290001_F-20-170-10K_02.jpg

図1 解析結果例
A: HeLa細胞溶解液より抽出したActinとGoat抗Actinポリクローナル抗体(品番:SC-1616)を使用し、免疫沈降を行った後、Goat 抗Actinポリクローナル抗体(品番:SC-1615)及びHRP標識Donkey 抗Goat IgG抗体を用いてWBを行った。
B: ImmunoCruz™ Optima D System(品番:SC-45041)を使用してIP/WBを行った。
AではH鎖とL鎖が見られるが、Bでは検出されていない。

ラインアップ

品名WB抗体
免疫動物種
IP抗体
免疫動物種
品番
ImmunoCruz™ IP/WB Optima A System Goat Rabbit or Mouse SC-45038
ImmunoCruz™ IP/WB Optima B System Mouse Goat or Rabbit SC-45039
ImmunoCruz™ IP/WB Optima C System Rabbit Goat or Mouse SC-45040
ImmunoCruz™ IP/WB Optima D System Goat Goat SC-45041
ImmunoCruz™ IP/WB Optima E System Mouse Mouse SC-45042
ImmunoCruz™ IP/WB Optima F System Rabbit Rabbit SC-45043

ImmunoCruz™ 免疫沈降/ウェスタンブロット検出システム

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

ImmunoCruzTM IP/WB Optima A System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45038

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

ImmunoCruzTM IP/WB Optima B System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45039

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

ImmunoCruzTM IP/WB Optima C System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45040

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

ImmunoCruzTM IP/WB Optima D System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45041

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

ImmunoCruzTM IP/WB Optima E System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45042

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

ImmunoCruzTM IP/WB Optima F System, Horseradish Peroxidase詳細データ

SCB

SC-45043

1 KIT
[0.5 ml]
販売終了

免疫沈降マトリックスの別売品

キットコンポーネントの1つである”免疫沈降マトリックス”が別売品として登場しました。
容量はキット内コンポーネント(2.0mL)の半分、1.0mLです。マトリックスが足りない!というお客様は、是非ご利用ください。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Preclearing Matrix A-rabbit, Rabbit詳細データ

SCB

SC-45052

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix B-goat, Goat詳細データ

SCB

SC-45053

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix C-goat, Goat詳細データ

SCB

SC-45054

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix D詳細データ

SCB

SC-45055

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix E詳細データ

SCB

SC-45056

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix F詳細データ

SCB

SC-45057

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix A-mouse, Mouse詳細データ

SCB

SC-45058

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix B-rabbit, Rabbit詳細データ

SCB

SC-45059

1 ML
[25% v/v]
販売終了

Preclearing Matrix C-mouse, Mouse詳細データ

SCB

SC-45060

1 ML
[25% v/v]
販売終了

UltraCruz™ ゲルインキュベーショントレイ

ゲルがくっつきにくい、便利なゲルインキュベーショントレイ
ポリスチレン製のUltraCruz™ ゲルインキュベーショントレイは、底面にある凹凸により、ゲルの付着を低減しました。

仕様
● ポリスチレン製  ● 最大容量:200ml  ● 丸い角に、耐久性のあるへり  ● 高さ:28mm、面積:70×96mm

UltraCruz(TM) ゲルインキュベーショントレイの概観図
図1 UltraCruz™ ゲルインキュベーショントレイの概観図

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

UltraCruz(R) Gel Incubation Tray, Blue詳細データ

SCB

SC-201755

1 PACK
[100/pack]
¥6,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Tray, Green詳細データ

SCB

SC-201756

1 PACK
[100/pack]
¥6,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Tray, Pink詳細データ

SCB

SC-201757

1 PACK
[100/pack]
¥6,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Tray, Yellow詳細データ

SCB

SC-201758

1 PACK
[100/pack]
¥6,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Tray, Orange詳細データ

SCB

SC-201759

1 PACK
[100/pack]
¥6,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Small Tray, Blue詳細データ

SCB

SC-358889

1 PACK
[100/pack]
¥3,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Small Tray, Green詳細データ

SCB

SC-358890

1 PACK
[100/pack]
¥3,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Small Tray, Orange詳細データ

SCB

SC-358891

1 PACK
[100/pack]
¥3,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Small Tray, Pink詳細データ

SCB

SC-358892

1 PACK
[100/pack]
¥4,000

UltraCruz(R) Gel Incubation Small Tray, Yellow詳細データ

SCB

SC-358893

1 PACK
[100/pack]
¥3,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

お問い合わせ

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