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蛍光アッセイより高感度！ Screen Quest™ カルシウムアッセイキット（発光）

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メーカー名：AAT Bioquest, Inc. (Former ABD Bioquest, Inc.)

Screen Quest™ カルシウムアッセイキットは特定部分における細胞内カルシウムの流動をモニターするためにお使いいただけます。たとえば組換えアポエクオリンタンパク質は特有の細胞小器官や細胞や組織を標的にすることができます。本キットはマイクロプレートルミノメーターでご使用いただける発光アッセイで、蛍光カルシウムアッセイより高感度です。

背景

カルシウム流動アッセイは、創薬研究分野において、Gタンパク質結合受容体(GPCR)スクリーニングとして非常によく用いられています。本キットは、細胞のカルシウムの指標として、カルシウムに高感度で膜透過性で、アポエクオリン遺伝子とトランスフェクトするセレンテラジンアナログを用いています。

アポエクオリンはオワンクラゲ由来のカルシウム感受性生物発光タンパク質で、細胞のカルシウム指示薬として広く用いられています。発光強度はCa²⁺ 濃度の割合で決まります。セレンテラジンを用いた本キットは蛍光を用いたアッセイキット(Fluo-4,Fluo-3,Calcium-3,Calcium-4など)より感受性が高く、Gタンパク質結合受容体やカルシウムチャネルをモニターするアッセイ法に最適化されています。また、96ウェルあるいは384ウェルマイクロタイタープレートフォーマットでのアッセイの自動化も容易です。

構成内容

セレンテラジンアナログ
エタノール
アッセイバッファー

使用例

Screen Quest カルシウムアッセイキットの使用例

図. CHO-aeq細胞におけるATP投与後の反応。CHO細胞はアポエクオリンと安定的にトランスフェクトし、96-ウェルwhite wall/clear bottom Costar プレートに50,000 cells/100 μL/wellで蒔いて一晩置いた。培地を除き、細胞を色素ローディング溶液100μLとScreen Quest™ Luminometric Calcium Assay Kitを用いて3時間室温で遮蔽してインキュベートした。NOVOstar (BMG Labtech) によってATP (25 μL/well) を添加し終濃度とした。ATPのEC50 は約0.8 μMである。

Screen Quest™ カルシウムアッセイキット（発光）

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Screen Quest^TM Luminometric Calcium Assay Kit	ABD	36305	1 KIT [10 Plates]	￥84,000
Screen Quest^TM Luminometric Calcium Assay Kit	ABD	36306	1 KIT [100 Plates]	お問い合わせ

【関連商品】発光カルシウム指示薬

エクオリンによるカルシウムアッセイについて

エクオリン複合体は、22,000-Daのアポエクオリンタンパク質、酸素分子、および発光団セレンテラジンから構成されています。３つのCa²⁺イオンがこの複合体に結合すると、セレンテラジンが酸化されセレンテラミドとなり、同時に二酸化炭素と青色光を放出します。エクオリン生物発光のCa2+濃度への依存度はおよそ3乗であることから、Ca²⁺濃度を~ 0.1 µM to >100 μMといった広い検出範囲で測定できます。蛍光Ca²⁺指示薬と異なり、Ca²⁺結合型エクオリンはサンプルを照射することなく検出できるため、自己蛍光からの緩衝を排除できます。AAT Bioquest社では、アポエクオリンcDNAを形質転換した後、細胞内でエクオリンを再構成するために、セレンテラジンやいくつかの合成セレンテラジンアナログを提供しています。また、天然セレンテラジンの他に、AAT Bioquest社ではエクオリン複合体に対して異なるCa²⁺親和性とスペクトル特性をもついくつかのセレンテラジン誘導体を提供しています。セレンテラジンhcpにより再構成された組換え型アポエクオリンは、量子収量がよく応答時間が迅速であるなど全体的に最も良好な発光を持つことが報告されています。しかし、セレンテラジンアナログからのエクオリン細胞内再構成は比較的ゆっくりです。セレンテラジン由来のcp、f またはhをもつエクオリンは、天然セレンテラジンから再構成されたアポエクオリン再構成物に比べて10-20倍強い発光をもちます。セレンテラジンhはGPCRのHTSスクリーニングアッセイに優先的に使用されています。

エクオリンを用いたカルシウムアッセイ原理
発光基盤のカルシウムアッセイでは発光団としてセレンテラジンhの使用が好まれる。

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Coelenterazine	ABD	21150	250 UG	￥18,000
Coelenterazine cp UltraPure grade	ABD	21151	250 UG	販売終了
Coelenterazine f UltraPure grade	ABD	21152	250 UG	￥24,000
Coelenterazine h	ABD	21153	250 UG	￥18,000
Coelenterazine hcp	ABD	21154	250 UG	￥24,000
Coelenterazine n UltraPure grade	ABD	21155	250 UG	￥24,000
Coelenterazine	ABD	21156	1 MG	販売終了
Coelenterazine cp UltraPure grade	ABD	21157	1 MG	販売終了
Coelenterazine f UltraPure grade	ABD	21158	1 MG	￥72,000
Coelenterazine h	ABD	21159	1 MG	￥24,000