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研究用

鳥インフルエンザAをRT-PCR で検出Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キット

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Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キットは、鳥インフルエンザAウイルス(H5N1型)の精製と検出に使用するキットです。

Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キット

背景

鳥インフルエンザウイルス

鳥類、ヒトおよび他の動物のインフルエンザウイルス感染は、公衆衛生上の世界的問題です。インフルエンザウイルスは、核タンパク質とマトリックスタンパク質の違いによって、A型、B型またはC型に分類されます。A型ウイルスは、3種のインフルエンザ型の中で最もヒト病原性が高く、深刻な症状とエピデミックを引き起こします。インフルエンザはさらに、二種類の表面糖タンパク質(ヘマグルチニンとノイラミニダーゼ)の抗原性の違いに基づいて、亜型(サブタイプ)に分類されます。A型インフルエンザの既知の亜型(H1-H16, N1-N9)は、すべて鳥類で見つかっており、一部の亜型(H1-H3, N1 and N2)はヒトでも見られます。しかしながら過去数年間で、H5N1型を含め、種々のA型インフルエンザウイルスの亜型はヒトにも感染することが報告されています(WHO, 2006)。さらに、ヒトインフルエンザウイルスと鳥インフルエンザウイルスの共存によって、ウイルス間で遺伝物質の交換が行われる可能性があります。このことは、ヒトに伝染し致死に至る新しい病原性インフルエンザ株を潜在的に生じさせるかもしれません(Food Safety Research Information Office, 2006)。したがって、動物およびヒトの両方でエピデミックやパンデミックのリスクを軽減するためにも、H5型インフルエンザウイルス感染症を迅速かつ早期に検出する高感度の診断試験が必要です。

使用目的

Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キットは、新型インフルエンザウイルスである、鳥インフルエンザAウイルス(H5N1型)の精製と検出に使用するキットです。

Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キットの使用方法

本製品では、Norgen社独自のスピンカラム技術(核酸の単離)を利用して、鳥インフルエンザAウイルス(H5N1型)RNAを精製します。

増幅のための H5N1型 RT-PCR マスターミックス、Isolation コントロールとPCRコントロールの2種類が付属しています。増幅したPCR産物は、アガロースゲル電気泳動、あるいはリアルタイムPCRで検出することができます(左図参照)。

RT-PCR 反応は、最初にウイルスRNAをcDNAに逆転写し、続けて H5型特異的断片を熱安定性ポリメラーゼを用いてPCRで増幅します。H5N1マスターミックスには、321 bp のウイルスゲノムを増幅する酵素と試薬が含まれています。さらに、Norgen社のAvian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キットは、コントロール 2X RT-PCR マスターミックスが二番目のマスターミックスとして含まれており、PCR コントロール(PCRC)と Isolation コントロール(IsoC)をそれぞれPCRすることで、PCRの阻害や不十分な分離を判定することができます。H5N1 RT-PCRプライマーセットとコントロールは、エンドポイントのRT-PCR検出で個別に利用できます。

 

特長

  • 高品質で阻害剤フリーのRNAを単離
     - 高濃度塩や代謝産物、タンパク質を除去することで高品質の濃縮RNAを精製
  • 迅速な操作
     - 3時間以内にH5N1型ウイルスを単離、検出
  • 正確性
     - 増幅バンドが明瞭に区別され、融解曲線はオーバーラップしません
  • 高い感度と特異性
     - 検出感度は5 x 104 copies/mL
  • キット構成品の単品購入も可能
     - H5N1型プライマーセットとポジティブコントロール、ネガティブコントロールを購入可能

構成内容

  • 溶解溶液
  • 洗浄液
  • 溶出バッファー
  • スピンカラム
  • コレクションチューブ
  • 溶出チューブ(1.7 mL)
  • H5N1 2X RT- PCR マスターミックス
  • コントロール 2X RT-PCR マスターミックス
  • Isolation コントロール (IsoC)
  • H5N1 Positive コントロール (PosC)
  • Nuclease Free-Water
  • Norgen’s DNA マーカー

プロトコール概要

A.ライセート調製(1分)

i)Sample Collection Kit によるライセート調製(品番:29100)(1分間)

  1. 300μLのサンプルを RNase-free の遠心チューブに移す。
  2. 300μLの溶解溶液を加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  3. 10μLのIsolationコントロールをライセートに加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  4. 300μLの95%エタノールをライセートに加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  5. RNAの単離に進む(ステップB)

ii)ウイルス輸送メディア中の検体のライセート調製(1分間)

  1. 200μLのサンプルを RNase-free の遠心チューブに移す。
  2. 500μLの溶解溶液を加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  3. 10μLのIsolationコントロール (IsoC) をライセートに加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  4. 400μLの95%エタノールをライセートに加え、10秒間ボルテックスで混合する。
  5. RNAの単離に進む(ステップB)

B.RNAの分離(9分)

  1. エタノール中のライセート(最大650μL)をカラムに添加し、14,000rpm で 1 分間遠心する。
  2. 400μLの洗浄液を加え、14,000rpm で 1 分間遠心する操作を3回繰り返す。
  3. 14,000rpm で 2分間遠心して、樹脂を完全に乾かす。
  4. 50μLの溶出バッファーをカラムに加え、2,000rpmで2分間遠心する。続けて、14,000rpm で 1分間遠心する。
  5. 精製RNAサンプルですぐにRT-PCRを行う。

C.H5N1 RT-PCR アッセイ(95 分)

  1. 1-5μLのRNAサンプルを10μLの H5N1 2x RT-PCR マスターミックス または コントロール 2x RT-PCR マスターミックスに加える。
  2. RT-PCR アッセイ(95 分)
  3. RT-PCR アッセイの結果確認

製品データ

培地中細胞のRNA 精製と検出はPCR阻害を引き起こさない
図1.培地中細胞のRNA 精製と検出はPCR阻害を引き起こさない

HeLa細胞を含む培地から、Total RNA 精製キットを用いて、トータルRNAを単離した。(Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キットは、Total RNA 精製キットと同じ技術を利用。)単離されたHeLa細胞のRNAをヒト5S遺伝子のプライマーでRT-qPCRに用いた。PCR の阻害物質を含まないことを試験するために、テンプレートとする溶出液の量を増やし(1、3、5 µL)PCRを行った。全てのテンプレート量で検出することができ、精製されたRNAの質の高さを示した。赤線:1 µL RNA、緑線:3 µL RNA、青線:5 µL RNA

鳥インフルエンザA H5N1型 の検出
図2.鳥インフルエンザA H5N1型 の検出

H5N1 2x RT-PCR マスターミックスを用いたH5N1ターゲットの増幅を示す1X TAE 1.7% アガロース電気泳動。 H5N1型ターゲットのアンプリコンは、DNAマーカー(M)の321 bp に対応する。 NC = Negative Control

PCRコントロール
図3.PCRコントロール

コントロール 2X PCR マスターミックスを用いたIsolation コントロールと PCR コントロールの増幅を示す1X TAE 1.7%アガロースゲル電気泳動。Isolation コントロールと PCR コントロールは、それぞれDNAマーカーの 499 bp と 150 bp に対応します。レーン1-5:Isolation コントロールと PCR コントロールの両方が検出できており、分離とPCR反応両方の成功を示す。レーン6:PCR コントロールのみ検出されており、PCRは成功している一方、分離で失敗している。NTC=Negative Control.

Avian Influenza A Virus(H5N1)RT-PCR 検出キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Avian Influenza A Virus (H5N1) RT-PCR Detection Kit詳細データ

NOG

35400

24 TEST
販売終了

[関連]Avian Influenza A Virus (H5N1) RT-PCR プライマーセット、コントロール

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Avian Influenza A Virus (H5N1) Primer Set and controls詳細データ

NOG

35410

100 RXN
販売終了

[関連]サンプルコレクションキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Sample Collection Kit For Upper Respiratory Tract Infectious Agents詳細データ

NOG

29100

1 KIT
[25 preps]
販売終了

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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