記事ID ： 11396

非特異的な反応を防ぐホットスタートマスターミックス Bioneer社 AccuPower® HotStart PCR PreMix

カテゴリから探す > 分子生物 > PCR > ポリメラーゼ/PCR関連試薬

メーカー名：Bioneer Corporation

AccuPower® HotStart PCR PreMixは、耐熱性のDNAポリメラーゼ、耐熱性のピロホスファターゼ、反応バッファー、dNTPs、トラッキングダイ、特許取得の安定剤を含む、ready-to-useのPCRマスターミックスです。ユニークな酵素を用いたホットスタート PCRで信頼性の高い結果が得られます。

AccuPower® PCR PreMix シリーズ

背景

ホットスタートPCRとは？

ホットスタートPCRとは、PCRの反応成分を混合したときに低温状態で起こる非特異的プライム、プライマーダイマー等の反応を最小限にすることで、増幅の特異性、産物の収率を向上する方法です。PCRプロセス中の不要な副反応は、通常室温で起こります。

一般的に、ホットスタート技術は、反応温度が高温（＞60℃）に達するまで、反応の必須成分を加えないようにするもので、通常、手動で実施します。しかし、この手法は煩雑かつ、コンタミネーションのリスクを高めます。

もう1つの手法として、低温でポリメラーゼに特異的に結合して重合を阻害する抗体を用いる方法があります。高温では抗体が解離し、ポリメラーゼの機能が解放されます。

その他の技術として、反応必須物質をワックスビーズに組み込み、高温で溶かして放出させる方法があります。

使用目的

Bioneer社のHotStart DNA ポリメラーゼは、ホットスタートPCR用にデザインされ、ピロホスファターゼとピロリン酸を用いることで、PCRの特異性を向上させました。HotStart DNA ポリメラーゼと独自のPCRバッファーを組み合わせることで、非特異的な増幅産物、プライマーダイマー、バックグランドを最小限に抑えます。複雑なゲノムやcDNAテンプレートなどを含む核酸、コピー数が非常に少ないターゲット、マルチプルプライマーペアなどの増幅反応に最適です。

HotStart DNA ポリメラーゼは、室温ではポリメラーゼ活性を持たない、不活化状態にあります。これにより、低温でのミスプライムやプライマーダイマーを防ぎます。HotStart DNA ポリメラーゼは、94℃、5分間のインキュベートをすることで活性化されるため、PCRの特異性を向上し、多くの場合PCR産物の収率を高めることもできます。PCRミクスチャーは、室温で調製することができ、簡便です。

また、AccuPower® HotStart PCR PreMixは、ホットスタートPCRの操作をシンプルで簡単にし、従来のホットスタート法の余分な操作やコンタミネーションのリスクを低減させます。

Bioneer社のHotStart DNA ポリメラーゼ
図1　Top DNA ポリメラーゼは低い温度（＜70℃）ではピロリン酸により阻害されています。耐熱性のピロホスファターゼは、温度が70℃を超えると、ピロリン酸を加水分解し、これによりポリメラーゼ反応に必要なMg²⁺が放出され、Top DNA ポリメラーゼが活性化します。これにより、反応のセットアップの間に起こるミスプライムやプライマーダイマーを防ぎ、PCRの特異性を向上します。

特長

簡便：テンプレートとプライマーを加えるだけでPCRがスタートできます
安定：室温で1ヶ月間、冷凍庫（-20℃）で2年間安定です
特異性：ユニークな酵素によるホットスタートで高い特異性が得られます

アプリケーション

ホットスタートPCR（最大12kb）
ゲノムやコピー数の少ないテンプレートのPCR
マルチプレックスPCR反応

仕様

5' - 3' エキソヌクレアーゼ活性： No
3' - 5' エキソヌクレアーゼ活性： No
末端転移酵素活性： Yes
フラグメントサイズ：最大12kb

使用例

AccuPower(R) PCR PreMixとの特異性比較
図2　AccuPower® PCR PreMixとの特異性比較
ヒトゲノムDNA 50ngを2.5～3kbフラグメントに増幅した。
A：AccuPower® PCR PreMix
B：AccuPower® HotStart PCR PreMix
レーンM：1kb DNA ラダー
レーン1：2.5kb PCR産物
レーン2：3.0kb PCR産物
HotStart PCR PreMixでは、プライマーダイマー及び非特異的産物が見られなかった。

図3　他社ホットスタートPCR試薬との特異性比較
ヒトゲノムDNAとプライマー2組（p53＋p55とp55＋p63）をPCRミクスチャーと混合し、マルチプレックスPCRの前に37℃で2時間インキュベートした。
M：100bp DNA ラダー
A：AccuPower® HotStart PCR PreMix
B：コントロール（AccuPower® PCR PreMix）
C：他社Tの抗体媒介ホットスタート Taq DNA ポリメラーゼ（0.5U）
D：他社Aの抗体媒介ホットスタート Taq DNA ポリメラーゼ（1.0U）

AccuPower® HotStart PCR PreMix

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
AccuPower^(R) HotStart PCR PreMix	BIN	K-5050	96 TUBE	￥16,000
AccuPower^(R) HotStart PCR PreMix	BIN	K-5051	480 TUBE	￥59,000
AccuPower^(R) HotStart PCR PreMix	BIN	K-5052	96 TUBE	お問い合わせ
AccuPower^(R) HotStart PCR PreMix	BIN	K-5053	100 TUBE	お問い合わせ
AccuPower^(R) HotStart PCR PreMix	BIN	K-5057	480 TUBE	お問い合わせ