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商品情報

記事ID : 10205
研究用

Gα活性を不活性化するRGSタンパク質のHTSアッセイRGScreen RGS Protein GAP Assays
Bellbrook社;Gα活性を不活性化するRGSタンパク質のHTSアッセイ

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Transcreener® GDP Assay kit、RGSタンパク質、Gαタンパク質を組み合わせて、Gα活性を不活性化するRGSタンパク質をHTSアッセイします。

背景

Regulator of G-protein signaling (RGS) タンパク質はGα活性を速やかに不活化する負の制御因子です。GPCRに共役する不活性型のGタンパク質はα、β、γから成るヘテロ3量体構造をとっており、GαサブユニットにGDPが結合しています。それに対して、GPCRによって活性化された活性型Gタンパク質はGαサブユニットからGDPを解離し、GTPと結合してGα-GTP(活性型Gα)とβγ複合体(Gβγ)に解離します(Fig.1)。 
活性型から不活性型への変換では、通常Gαサブユニットの初期GTPase活性が、Gαに結合するGTPをGDPに加水分解することで、Gタンパク質ヘテロ3量体を再結合させます。しかし、この初期活性はGタンパク質不活性化への生理的速度に一致するには不十分です。 ここでRGSが、Gα-GTPの初期GTP加水分解速度を高めることによってシグナル伝達の終了を手助けすることから、GTPase- accelerating proteins (GAP)としての役割を持ちます。
RGSはGPCRアゴニストを調節する可能性と共に、治療ターゲットとして注目されています。

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(Figure 1) RGS Proteins as GTPase-accelerating Proteins

特長

●  RGSをユニバーサルに検出: RGSのGAP活性を測定するHTSアッセイ
●  9種類のRGSリコンビナント: RGScreen GAPアッセイでバリデーション済みのRGSドメインパネル
●  Gα変異体タンパク質: GDP解離の検出が可能な4種類のGα変異体タンパク質
●  Transcreener® GDP Assay kit: RGSのGAP活性検出に使用

アッセイ原理

RGSのGAP活性を測定するユニークなバリデーション済みHTSアッセイ

RGS機能検出に最も直接的な方法は、Gαタンパク質のGTPase活性増加を測定する事です。しかし、単離したGαタンパク質のGDP解離は非常に遅く、Gαタンパク質のGTPase活性が制限されるため、RGSのGAP活性が測定できません。 そこでBellBrook社のRGScreenプラットフォームでは、検出可能な速度でGDP解離が可能なGα変異体を構築し使用します。RGSがGα変異体を刺激し、解離したGDPをTranscreener® GDP Assayで検出します。

 Transcreener® GDP Detection Mixture にはGDP抗体に結合するGDP 蛍光標識トレーサーが含まれています。GαのGTPase活性により生じたGDPは、抗体に結合しているトレーサーと置換され、遊離したトレーサーの蛍光変化を測定します(Fig. 2)。Transcreener® GDP assay kit には、蛍光偏光法(FP)および蛍光強度法(FI)の2種類の検出法があります。

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(Figure 2) Use of Transcreener® GDP Assay to monitor RGS GAP activity by immuno-detection of GDP generation in HTS assay format

試験例

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(Figure 3)
(A) Gαタンパク質(0.6 ng/μL)存在下におけるRGS4の力価測定。これによってRGS4最適濃度を2 ng/μLと決定した。
(B) RGS4 (Part# 8005)の存在下/非存在下におけるGαi1 (R178M,A326S)の RGScreen™ Assay例。
Transcreener GDP assay試薬を30℃、ゼロ時間において酵素反応に添加し、15分間隔で測定した。最終的な反応液量は20 ulで、組成は以下のとおり。(1 ng/μL Gαi1 (R178M,A326S), 20 mM Tris 7.5 pH, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 10 μM GTP, 10 μg/mL GDP Antibody, and 4 nM GDP AlexaFluor® 633 Tracer)
(C) GTP/GDP標準曲線からGTPase速度 (μmol GDP x mg-1x min-1)を決定。

 

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(Figure 4) 960化合物ライブラリーに対するRGS4存在下/非存在下におけるGαi1変異体のPilot GenPlus Library Screen。(A)RGS4存在下。(B)RGS4非存在下。
CCG-4686はRGS4阻害剤である。測定されたシグナルの範囲 (平均値 [μ]+3標準偏差[σ]) を点線で示した。(A)では、120分後のZ値が0.83で、コントロールのGTPase活性がRGS4存在下で増加した。GenPlus library screenのZ値は0.73で、ヒット化合物を含むウェルの値を除いて得られた。(A)における17ヒットは3 StdDevs、10はBによってGTPase阻害剤として除かれた。従ってRGS4特異的ヒット率は0.7%だった。

 

 

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(Figure 5) Gα変異体のGαi1 および Gαo における、RGS4 の効果

商品リスト

商品カテゴリ 品名
Transcreener® GDP Assay Transcreener® GDP FP Assay (蛍光偏光法)
Transcreener® GDP FI Assay (蛍光強度法)
Kinetically Enhanced Gα Proteins Gα0 (R179M,A327S) with Gα Enzyme Buffer
Gαi1 (R178M,A326S) with Gα Enzyme Buffer
Gαi2 (R179M,A327S) with Gα Enzyme Buffer
Gαi3 (R178M,A326S) with Gα Enzyme Buffer
Purified RGS Protein Domains RGS2 (71-209)
RGS4 (29-198)
RGS10 (16-151)
RGS12 (101-261)
RGS14 (56-207)
RGS16 (53-190)
RGS17 (72-206)
RGS18 (75-223)
RGS19 (79-205)

上記は、1,000 assay 分の試薬になります。

【受託サービス】

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BellBrook社では、RGScreen プラットフォームの受託サービスも行っています。RGSタンパク質パネルや、Gαタンパク質パネルを使用した選択的プロファイリングもございます。詳細はお問い合わせください。

 

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お問い合わせ先 : 営業部 創薬営業ユニット

価格等詳細につきましては、当社 営業部 創薬営業ユニット までお問合せください。

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FAX
03-5632-9614
E-mail
dds_info@cosmobio.co.jp

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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