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記事ID : 16637
研究用

細胞間相互作用や細胞の近接(cell proximity)を検出MarkerGene™ 細胞近接アッセイキット

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MarkerGene 細胞近接アッセイキット
細胞近接のイメージ

本製品は96ウェルプレートで細胞間相互作用を発光検出するキットです。
MGT社では、2種類の酵素が相互作用すると発光するような独自の化学発光基質を利用し、細胞近接を測定する新しいアッセイシステムを提供しています。

 

背景

細胞間相互作用とは?

細胞間コミュニケーションは高等生物の成長、発達において必要不可欠な要素です。このような細胞間相互作用は、細胞間接触阻止(contact inhibition)、器官の正常な発生、細胞移動など多くの生物学的制御機構に関係しています。
またがん細胞などの転移開始や、宿主-病原体感染メカニズムなどの病理にも関連しています。

使用目的

2種類のマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼ (lacZ) とMGT社独自の赤色ルシフェラーゼ (rluc)がそれぞれ搭載されたベクターを別々の細胞株にトランスフェクトし、それから両細胞株を共培養します。続いてMGT社独自の細胞透過性基質を加えるとlacZ+細胞が産生するβ-ガラクトシダーゼにより基質が化学発光用基質へ開裂します。その際、ルシフェラーゼを産生する rluc+細胞がlacZ+細胞に近接していれば、発光が検出されます。放出された赤色波長 (λ = 619 nm)の光を定量することで、細胞近接および細胞間相互作用の目安にすることができます。放出される光シグナルは、細胞数に依存し、各トランスフェクション細胞株の密度と共に変化します。酵素および基質は細胞透過性があるため、基質添加前や測定前に細胞をライセートにする必要はありません。

アッセイ原理

特長

  • 独自の発光システムを採用
  • 高コピー数または発現効率の高いベクターを使用(pDC57、pCMVβ
  • 各種トランスフェクション法に対応
  • 96ウェルフォーマット。マイクロプレートリーダーで検出

構成内容

  • 赤色ルシフェラーゼベクター
  • β−ガラクトシダーゼベクター
  • 基質
  • 反応バッファー

*キットにはベクターが含まれており、細胞にトランスフェクトする必要があります。トランスフェクション試薬等は含まれておりませんので、別途ご購入いただく必要があります。

プロトコール

トランスフェクション法について

樹立細胞株(HeLa、293、CHO細胞など)を使用する場合は、オリジナルの文献や細胞株の提供元が推奨しているプロトコールに準じてください。
各種トランスフェクション法に対応可能です(リン酸カルシウム法、リポフェクション、エレクトロポレーション、カチオン性ポリマー法)。

 

細胞アッセイ

  1. ベクター(凍結乾燥品)を脱イオン水20µLに溶解し、1µg/µLのストック溶液を準備します(-20℃保存)。
  2. 基質を濃度1.5mg/mLで反応バッファーに溶解します(-20℃保存)。
  3. 細胞を各トランスフェクション法に応じた推奨の細胞密度で播種し、一晩インキュベートします。
  4. 各ベクターをウェルもしくはプレート内で細胞にトランスフェクトします。詳細は各種トランスフェクションのプロトコールに従ってください。トランスフェクトした細胞を一晩インキュベートします。
  5. 細胞を回収します。96ウェルプレートで各ベクターがトランスフェクトされた細胞をそれぞれ1X104個ずつ(計2X104個)播種して混合し、一晩インキュベートします。
    混合例:各細胞の密度が2X105個/mLの場合、各細胞懸濁液を50µLずつ(計100µL)混合します。
  6. 基質を添加する最低1時間前に培地をアスピレーターで除去し、新鮮な培地50µLに交換します。
  7. 各ウェルに基質50µLを添加し、プレートリーダーで発光を測定します。酵素と基質が反応し、安定した発光シグナルを放出するには15分程度かかります。rluc+細胞もしくはlacZ+細胞のみからは、発光シグナルは検出されません。

アッセイ手順

使用例

Hela細胞を用いたキット付属の基質とD-ルシフェリンでの発光を比較

図1. Hela細胞を用いたキット付属の基質とD-ルシフェリンでの発光を比較
Hela細胞にjetPRIME(カチオン性ポリマー法)で赤色ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼベクターをトランスフェクトし、翌日細胞を回収して2X104個/ウェルで再度播種した(rluc+細胞とlacZ+細胞の混合比は1:1)。
それぞれキット付属の基質50µLとD-ルシフェリン50µLを各ウェルに添加し、Tecan Infinite M200Proで発光を測定した。

参考文献

  1. Sellmyer M, Bronsart L, Imoto H, Contag C, Wandless T, Prescher J (2013) "Visualizing cellular interactions with a generalized proximity reporter" Proc Natl Acad Sci 110(21):8567–8572.
  2. Jones KA, David J. Li DJ, Hui E, Sellmyer MA, Prescher JA, (2015) "Visualizing cell proximity with genetically encoded bioluminescent reporters" ACS Chem. Biol. , 10: 933-938.
  3. Porterfield WB, Prescher JA (2015) "Tools for visualizing cell-cell interactomes." Curr. Opin. Chem. Biol. 24: 121-130.
  4. Germain RN, Robey EA, Cahalan MD (2012) "A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system." Science 336: 1676-1681.
  5. Paley MA, Prescher JA (2014) "Bioluminescence: A versatile technique for imaging cellular and molecular features." Med. Chem. Comm. 5: 255-267.

MarkerGene™ 細胞近接アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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