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アデノウイルス導入試薬・金磁性複合ナノ粒子 GoldMAN™

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GoldMAN™は、酸化鉄粒子に複数の金コロイドが付着した金磁性複合ナノ粒子です（図１）。タンパク質中のシステインやメチオニンのような含硫アミノ酸が、金コロイドとAu－S結合で強固に結合し、金コロイドが付着している酸化鉄粒子の磁性によって、アデノウイルスを細胞内に導入します。アデノウイルスの細胞内進入に必要とされるCAR（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor）が低発現の細胞へも、GoldMAN™とアデノウイルスベクターを結合させて、磁力によって細胞内に導入することが可能です。

アデノウイルス導入試薬・金磁性複合ナノ粒子 GoldMAN
図1

使用実績のある細胞

	詳細	遺伝子発現上昇*	CAR発現レベル
B16BL6	マウスメラノーマ細胞株	3,000倍	Low
NIH3T3	マウス胚線維芽細胞	800倍	Low
Colon26	マウス大腸癌細胞株	600倍	Middle
A549	ヒト肺腺癌細胞株	15倍	High

使用方法

■ 金磁性ナノ粒子を用いた遺伝子導入プロトコール

【準備するもの】

アデノウイルスベクター
金磁性ナノ粒子 (0.2 mg/ml; 金 0.1 mg/ml、鉄 0.1 mg/ml)
細胞 (例； B16BL6細胞)
6、24又は96-well plate (Flat型)
Magnetic Plate (OZ BioScience, France)
CO₂インキュベーター

【プロトコール】

1日目:
細胞の準備

6、24又は96-well plateにB16BL6細胞を以下の表に示す量で播種
37℃、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で12 - 24時間培養する。

Table 1 The number of B16BL6 cell and the volume of growth medium in each plate.
Plate	Number of plated cells	Volume of growth medium
6-well plate	1.2 x 10⁵ – 2.5 x 10⁵	2500 μl/well
24-well plate	2.5 x 10⁴ – 5.0 x 10⁴	500 μl/well
96-well plate	5.0 x 10³ – 1.0 x 10⁴	100 μl/well

2日目:
アデノウイルスベクター/金磁性ナノ粒子複合体の調製

アデノウイルスベクターを2.0 x 10⁷ vp/µlに調製する。
Ad溶液と金磁性ナノ粒子溶液を以下の表に示す割合で混合し、室温で5分静置する。

Table 2 The volume of Ad solution and GoldMAN solution.
Plate	Volume of Ad solution	Volume of GoldMAN solution
6-well plate	125 μl/well	125 μl/well
24-well plate	25 μl/well	25 μl/well
96-well plate	5 μl/well	5 μl/well

遺伝子導入

細胞培養プレートの底面にプレート底面にマクネッティックプレートを装着する。
Ad/金磁性ナノ粒子混合溶液（Table 2）を全量、細胞培養液中に添加し、37°C、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で1時間培養する。
プレートからマクネッティックプレートをはずし37°C、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で24時間培養する。

3日目:
遺伝子発現特性評価

Adに搭載されたレポーター遺伝子の発現量を指標に遺伝子導入特性を評価する。

使用例

図3、Ad/GoldMAN™複合体のB16BL6 CAR (-)細胞への遺伝子導入(Fig.1使用)
Ad/GoldMAN™複合体による遺伝子導入効率は、Ad-EGFPの1.0 x 10⁸ vpを使用して評価した。B16BL6細胞のEGFP発現は、蛍光顕微鏡によって観察した。
(A) 磁力なしの条件で、Ad-EGFP/GoldMAN™複合体をトランスフェクションした。
(B)-(D) 磁力をかける時間を(B)15分、(C)30分、(D)60分でAd-EGFP/GoldMAN™をトランスフェクションした。

図4、Ad/GoldMAN™複合体のNIH3T3細胞とA549細胞への遺伝子導入(Fig.2使用)
Ad/GoldMAN™複合体による遺伝子導入効率は、Ad-Luc (Luciferase expressing Ad)の1.0 x 10⁸ vp を使用して評価した。(A)NIH3T3 CAR(-)細胞、(B)A549 CAR(+)細胞。

図5、GoldMAN™による形質導入の効率と安全性(Fig.3使用)
(A) ルシフェラーゼアッセイ
Ad-Luc (Luciferase expressing Ad)の1.0 x 10⁸ vpを使用して、Ad/GoldMAN™の遺伝子発現を定量した。連続的に希釈したGoldMAN™をAd-Lucと混合し、ルシフェラーゼ発現(RLU)を市販のアッセイシステムによって測定した。緑色の範囲は、形質導入の効率と安全性における最適条件を表す。
(B) ³H-チミジン取り込みアッセイ
Ad/GoldMANの細胞毒性を[³H]-チミジンの取り込みによって評価した。緑色の範囲は、形質導入の効率と安全性における最適条件を表す。

参考文献

1.　Direct cell entry of gold/iron-oxide magnetic nanoparticles in adenovirus mediated gene delivery. Kamei K, Mukai Y, Kojima H, Yoshikawa T, Yoshikawa M, Kiyohara G, Yamamoto TA, Yoshioka Y, Okada N, Seino S, Nakagawa S. Biomaterials. 2009, 30(9):1809-14.
2.　Functionalization of magnetic gold/iron-oxide composite nanoparticles with oligonucleotides and magnetic separation of specific target. Kinoshita T, Seino S, Mizukoshi Y, Nakagawa T, Yamamoto TA., J Magn Magn Mater., 2007, 311:255-258.
3.　Synthesis of gold/magnetic iron oxide composite nanoparticles for biomedical applications with good dispersibility. Seino S, Kusunose T, Sekino T. Kinoshita T, Nakagawa T, Kakimi Y, Kawabe Y, Iida J, Yamamoto TA, Mizukoshi Y. J Appl Phys., 2006, 99:08H101

GoldMAN™

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
ゴールドマン磁性金ナノ粒子複合体 (アデノウィルス用遺伝子導入試薬) / GoldMAN Magnetic Gold nanoparticle complex	CSR	A1000	2 ML	￥60,000