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フィブロネクチンと細胞接着 CYTOSKELETON NEWS 2012年6月号

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メーカー名：Cytoskeleton, Inc.

細胞フィブロネクチン（FN）は不活性な可溶型で細胞から分泌される二量体糖タンパク質です。細胞表面に付着した後、FNは脊椎動物の細胞外マトリクス（ECM）の機能性構成物として偏在している不溶型の原線維へと重合します（1, 2）。FNサブユニットは主にスプライシングの違いにより230-270 kDaの範囲でサイズ分けされます（3）。フィブロネクチンはインテグリン（4）、シンデカン-4（5）、ゼラチン/コラーゲン（6）、成長因子（7）、ヘパリン（8）、フィブロネクチン（3）を含む多数の標的分子との結合部位を有する複雑なマルチドメインタンパク質です。このニュースレターでは細胞接着と不溶性フィブロネクチンマトリクスの集合（原線維形成）におけるフィブロネクチンの役割に焦点を当てます（図1）。どちらのプロセスもRhoファミリー低分子Gタンパク質により制御を受けます。

図1：フィブロネクチン関連細胞接着と原線維形成に関するシグナリングイベントの図示

フィブロネクチンと細胞接着

平面培養での接着性細胞の多くがインテグリン膜貫通型受容体との相互作用により可溶性フィブロネクチンと結合しています（9）。細胞がフィブロネクチンと結合することで、細胞の伸展と早期フィブロネクチン駆動インテグリンクラスター化が生じます。インテグリンクラスター化は低分子量GTPase RhoAの活性化を介した細胞内の収縮力により促進されます（10）。RhoAの活性化は、ATPase（力の生成）と活性化アクチンモータータンパク質であるミオシンIIの架橋能力の活性化が順に生じる、Rhoキナーゼ（ROCK）下流の活性化へとつながります（11）。ミオシンによるアクチンフィラメントの架橋はアクチンストレスファイバーの形成を起こします。ストレスファイバー上のモーター活性は、インテグリンクラスター化の促進と、クラスターへのアクチンとシグナルタンパク質、構造タンパク質、膜貫通タンパク質のようなアクチン結合タンパク質の取り込みを起こす張力を生じます。このクラスター化とタンパク質取り込みの結果、焦点結合（FA）は運動性と可溶性フィブロネクチン基質への細胞接着と関与する複合体を形成します。

フィブロネクチンマトリクス集合（原線維形成）

フィブロネクチンマトリクス集合は、細胞がフィブロネクチン基質と接着した後まもなく焦点接着の核となります（12）。重合に関与する主要なフィブロネクチンのドメインは最近の論文により詳細に調査報告されています（3）。マトリクス集合にはFN-FN相互作用と早期原線維形成に必要なフィブロネクチン結合部位を露出させる構造変化を誘導する、RhoA駆動細胞伸縮性を必要とします（13）。活性化焦点接着キナーゼ（FAK）を含め、焦点接着で機能する他のシグナル経路も原線維形成において必須であることが見出されています（14）。マトリクス集合の最終段階では界面活性剤であるデオキシコール酸（DOC）可溶性のフィブロネクチンフィラメントからDOC不溶性のマトリクスへの成熟を伴います。このプロセスはFN二量体から原線維への連続的な沈着により成し遂げられます（15）（図1）。原線維形成の動態は蛍光標識フィブロネクチンを使用することで簡単に追跡できます（13）。

トレンドと今後の動向

ここ10年の間に、ECM環境は単に細胞の支持体なだけでなく、むしろ生存、寿命、分化、形態、極性、移動性を制御するため細胞との間で行動のシグナルを連続的に授受する高度な複合体構造であることが明らかになってきました（7）。平面培養をやめてより生理的な三次元培養を支持する最近の風潮は研究業界に広がりつつあり、また現在多くの三次元ECM商品が存在しています（16）。他の興味深い新情勢として三次元技術を創薬や個別医療にも供しようとする試みがあります（16）。EMC構成の評価と複製を要求するであろう幹細胞の分化や組織再生の解明がフィブロネクチン研究の原動力となります（17）。

参考文献

1. Williams E.C. et al. 1982. Conformational states of fibronectin. Effects of pH, ionic strength, and collagen binding. J. Biol. Chem. 257:14973-14978.
2. Hynes R.O. & Zhao Q. 2000. The evolution of cell adhesion. J. Cell Biol. 150:F89-F96.
3. Schwartzbauer J.E. & DeSimone D.W. 2011. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3:a005041.
4. Dubash A.D. et al. 2009. Focal adhesions: New angle on an old structure. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 277:1-65.
5. Woods A. et al. 1986. Adhesion and cytoskeletal organization of fibroblasts in response to fibronectin fragments. EMBO J. 5:665-670.
6. Owens R.J & Baralle F.E. 1986. Mapping the collagen binding site on human fibronectin by expression in Escherichia coli. EMBO J. 5:2825-2830.
7. Hynes R.O. 2009. The extracellular matrix: Not just pretty fibrils. Science. 326:1216-1219.
8. Bultmann H. et al. 1998. Fibronectin fibrillogenesis involves the heparin II binding domain of fibronectin. J. Biol. Chem. 273: 2601-2609.
9. Huveneers S. et al. 2008. Binding of soluble fibronectin to integrin a5b1: Link to focal adhesion redistribution and contractile shape. J. Cell Sci. 121:2452-2462.
10. Cox E.A. et al. 2001. Integrin-mediated adhesion regulates cell polarity and membrane protrusion through the Rho family of GTPases. Mol. Biol. Cell. 12:265-277.
11. Chrzanowska-Wodnicka M. & Burridge K. 1996. Rho stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. J. Cell Biol. 133:1403-1415.
12. Christopher R.A. et al. 1997. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Sci. 110: 569-581.
13. Pankov R. et al. 2000. Integrin dynamics and matrix assembly: Tensin-dependent translocation of alpha5beta 1 integrins promotes early fibronectin fibrillogenesis. J. Cell Biol. 148:1075-1090.
14. Ilic D. et al. 2004. FAK promotes organization of fibronectin matrix and fibrillar adhesion. J. Cell Sci. 117:177-187.
15. McKeown-Longo P.J. et al. 1983. Binding of plasma fibronectin to cell layers of human skin fibroblasts. J. Cell Biol. 97:466-472.
16. Gurski L.A. et al. 2010. 3D Matrices for anti-cancer drug testing and development. Oncology Issues. Jan/Feb: 20-25.
17. Owen S.C. & Shoichet M.S. 2010. Design of three-dimensional biomimetic scaffolds. J. Biomed. Mat. Res. 94A:1321-1331.

ECMタンパク質

蛍光標識またはビオチン標識したフィブロネクチンとラミニン商品群を提供しています

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Fibronectin, Bovine, HiLyte Fluor^TM 488	CYT	FNR02-A	5*20 UG	￥112,000
Fibronectin, Bovine, HiLyte Fluor^TM 488	CYT	FNR02-B	20*20 UG	￥313,000
Fibronectin, Bovine	CYT	FNR03-A	5*20 UG	￥112,000
Fibronectin, Bovine	CYT	FNR03-B	20*20 UG	￥313,000
Laminin, Mouse	CYT	LMN01-A	5*20 UG	￥120,000
Laminin, Mouse, HiLyte Fluor^TM 488	CYT	LMN02-B	20*20 UG	￥313,000
Laminin, Mouse, HiLyte Fluor^TM 488	CYT	LMN02-A	5*20 UG	￥120,000
Laminin, Mouse, HiLyte Fluor^TM 488	CYT	LMN02-B	20*20 UG	￥313,000
Laminin, Mouse, Biotin	CYT	LMN03-A	5*20 UG	￥120,000
Laminin, Mouse, Biotin	CYT	LMN03-B	20*20 UG	￥313,000

低分子量Gタンパク質活性化アッセイ

Cytoskeleton社のG-LISAでは低分子Gタンパク質活性化アッセイを迅速かつ高感度に行えます

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
RhoA G-LISA^(R) Activation Assay (absorbance)	CYT	BK124	96 ASSAY	￥280,000
RhoA G-LISA^(R) Activation Assay (luminescence)	CYT	BK121	96 ASSAY	￥280,000
RhoA Pulldown Activation Assay Kit	CYT	BK036	1 KIT [80 assays]	￥241,000
Rac1,2,3 G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK125	96 ASSAY	￥280,000
Rac1 G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK128	1 KIT [96 assays]	￥280,000
Rac1 G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK126	1 KIT [96 assays]	￥280,000
Rac1 Pulldown Activation Assay Kit	CYT	BK035	1 KIT [50 assays]	￥241,000
Cdc42 G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK127	96 ASSAY	￥280,000
Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit	CYT	BK034	1 KIT [50 assays]	￥241,000
RalA G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK129	1 KIT [96 assays]	￥280,000
RalA Activation Assay Biochem Kit	CYT	BK040	50 ASSAY	納期未定お問い合わせ
Ras G-LISA^(R) Activation Assay Kit	CYT	BK131	1 KIT [96 assays]	￥280,000
Ras Activation Assay Biochem Kit	CYT	BK008	1 KIT [50 assays]	￥225,000

G-switch™活性化剤と阻害剤

内因性Rhoタンパク質活性の制御で最も明らかになっている経路

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Rho Activator II	CYT	CN03-A	3*20 UG	￥65,000
Rho Activator II	CYT	CN03-B	9*20 UG	￥181,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based), Clostridium botulinum , Unlabeled	CYT	CT04-A	1*20 UG	￥63,000
Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based), Clostridium botulinum , Unlabeled	CYT	CT04-B	5*20 UG	￥205,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I	CYT	CN04-A	3*20 UG	￥65,000
Rho/Rac/Cdc42 Activator I	CYT	CN04-B	9*20 UG	￥181,000
Rho Pathway Inhibitor I (Rho Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632)	CYT	CN06-A	5*10 UNIT	販売終了
Rho Pathway Inhibitor I (Rho Kinase (ROCK) Inhibitor Y-27632)	CYT	CN06-B	20*10 UNIT	販売終了
Rho Activator	CYT	CN01-A	5*10 UNIT	￥65,000
Rho Activator	CYT	CN01-B	20*10 UNIT	￥234,000
Rac and Cdc42 Activator	CYT	CN02-A	5*10 UNIT	￥65,000
Rac and Cdc42 Activator	CYT	CN02-B	20*10 UNIT	￥234,000