βアレスチンリクルートメントおよび内在化を指標としたGPCRプロファイリング向け細胞株 PathHunter® β-Arrestin / 内在化 GPCR安定発現細胞株
DiscoverX社；β-アレスチン活性評価に最適なGPCR安定発現細胞株

GPCRシグナルに関与する創薬研究では、GPCRに直接結合するアレスチン（β-Arrestin）、GPCRと共役するGタンパク質下流シグナル（Second Messenger）、GPCRの内在化／エンドサイトーシス（Internalization）による評価法が注目されています(右図参照)。

DiscoverX社は、オーファンGPCRを含む490種類以上のハイスループットに対応したGPCR安定発現細胞株を提供しています。アレスチンのリクルートメントを利用したGPCR活性評価およびセカンドメッセンジャー（cAMPおよびカルシウム）によるGPCR活性評価、GPCR 内在化を指標とした機能的な活性評価など、様々な側面からGPCR機能およびGPCRを標的とする化合物の解析が可能です。

セカンドメッセンジャーの検討のための細胞株につきましては、別ページで紹介しています。

また、本細胞株を用いたeasy-to-useのアッセイキットの販売および受託サービスも行っております。

• 各種GPCR評価系における細胞株およびキットのターゲットリスト
• PathHunter® eXpress β-Arrestin / 内在化GPCRアッセイキット
• GPCRプロファイリング&スクリーニングサービス

本細胞株によるアッセイでは、DiscoverX社独自の技術；Enzyme Fragment Complementation（EFC）技術を用いて様々な検出システムを確立しています(Fig. 1)。

Known GPCR / Orphan GPCR β-arrestin recruitment

GPCRにリガンドが結合することによりβ-arrestinがリクルートされ、続いて下流のシグナル伝達が誘導されます。既知GPCRおよびオーファンGPCRでは、GPCRリガンドの結合によってβ-arrestinがリクルートされると、GPCRのC末端側に結合したβ-galactosidaseのSmall fragment (ED)と、β-arrestinに付加されたβ-galactosidaseのLarge fragment (EA)とが再構成されて活性型酵素となります。このβ-galactosidase活性により加水分解された基質の化学発光シグナルを測定することにより、GPCRに対する化合物の作用を同定します。(Fig. 2)

Fig1. Enzyme Fragment Complementation（EFC）技術

Fig2. EFC技術による化学発光検出の原理

GPCR Internalization

PathHunter® GPCR Internalization アッセイでは、Activated Internalization アッセイ 及び Total Endocytosis アッセイ 2つの異なるアッセイ原理があります。

Fig.3. Activated GPCR Internalization assay原理	Fig4. Total Endocytosis assay原理
1. Activated　Internalization Activated Internalizationアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、β-arrestinに融合された相補的な酵素断片を用います。β-arrestinはターゲット受容体の刺激によりGPCRに結合し、受容体の内在化、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、２つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。	2. Total Endocytosis Total Endocytosisアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、ターゲット受容体に付加された相補的な酵素断片を用います。リガンドやアゴニストの刺激によりターゲット受容体が細胞内に取り込まれ、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、β-arrestinに依存せずに２つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。

• 細胞培養接着後、数時間でアッセイ可能な簡便プロトコール（下記プロトコールを参照）
• 化学発光検出、簡便なプロトコールによるハイスループットスクリーニングアッセイ
• 目的ターゲットの同ファミリーや動物種のプロファイリングに最適
• オーファンGPCRや異なるGタンパク質(Gi, Gq, Gs)とカップリングする様々なGPCRに対して、横断的に化合物の特異性や選択性の比較が可能(Fig. 5)
• アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターの他、部分アゴニストやインバースアゴニストの同定も可能(Fig. 6)

β-arrestin recruitment

• リガンド結合に続いて最初に起こるシグナル伝達を確認可能な細胞ベースのアッセイ
• 受容体とβ-arrestinの1:1の結合を見ることにより、偽陽性・偽陰性の少ないデータの入手が可能

Internalization

• スーパーアゴニストや機能的アンタゴニストなどの評価に適した機能的アッセイ

Fig5. PathHunterによるGi/Gq/Gsタンパク質それぞれの評価

1. 細胞を解凍後、96 または384wellプレートに播種 (24時間、37℃)
2. 被験物質溶液を加える(DMSOまたはEtOH)、(90分以上、37℃)
3. 検出試薬を加える (60分、室温)
4. 化学発光シグナルを検出(検出機器：Viewlux, Victor, Turnerなど)

こちらをご参照ください。　 ターゲットリスト

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