チロシンキナーゼ阻害剤の解析に最適なセルベースのスクリーニングサービス PathHunter® Cell Based Kinase Assay受託サービス
DiscoverX社；セルベースの、チロシンキナーゼ阻害剤スクリーニングに最適な受託サービス

チロシンキナーゼは、抗腫瘍薬のターゲットとしてその阻害剤の開発が脚光を浴びている一方で、副作用の低減や、特異性の向上を目的として、伝統的なキナーゼ阻害剤に加え、アロステリックモジュレーターや抗体医薬の新規開発も進んでいます。一般的な阻害剤のスクリーニングでは、精製キナーゼを用いた生化学的手法では、化合物と標的キナーゼの結合を評価しているため、生体内で活性を持つ化合物の探索は困難となります。DiscoverX社が提供するPathHunter® Cell Based  Kinase Assayは、受容体型チロシンキナーゼと非受容体型チロシンキナーゼに対して、迅速かつ大規模な細胞ベースの阻害剤スクリーニングにも対応可能な受託サービスをご提供しております。

• ヒト由来全長タンパク質を発現させることにより、同一評価系においてリガンド結合能、受容体の二量体化、キナーゼ活性に対する化合物など、細胞膜浸透性を加味した評価可能
• 低分子キナーゼ阻害剤からブロッキング抗体などの高分子タンパク質、アロステリックモジュレーター、siRNAの同定が可能
• 化学発光に基づくHTSセルベースアッセイ

受容体型チロシンキナーゼ（Receptor Tyrosine Kinase Assay）は、癌、代謝、免疫など様々な疾患に関与しています。
DiscoverX社が開発した本システムでは、全長タンパク質を発現した細胞株を用いておりますので、細胞内環境における受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態をモニタリングできます。

Figure.1  PathHunter® Cell based Kinase Assay原理

【原理】

PathHunter® Cell Based Kinase Assayでは、C末端にProlink (PK)標識されている受容体型チロシンキナーゼ単量体と、SH2ドメインを持つアダプタープロテイン-Enzyme Acceptor(EA)融合タンパク質を、細胞内に強制発現させています。リガンド結合によって受容体の二量体化が起こり(homodimerization, heterodimerization)、続いて受容体がリン酸化されると、SH2ドメインを持つアダプタープロテインがリクルートされ、受容体シグナル伝達複合体(Receptor signaling complex)が形成されます。それに伴い、空間的に隣接したPKとEAの結合が促され、活性型β-ガラクトシダーゼが再構成されます。このβ-ガラクトシダーゼ活性による加水分解された基質の化学発光シグナルのレベルを測定することにより、受容体型チロシンキナーゼに対する化合物の作用を同定します。

【適用】

• 一次、二次スクリーニングからのヒット化合物の探索
• 低分子阻害剤、抗受容体抗体、抗リガンド抗体の探索
• 抗体医薬品やアロステリックモジュレーターの作用機序の評価(figure.2)
• 細胞表面の相互作用の探索

Figure.2 抗体医薬品やリガンド結合阻害評価データ
A series of commercially available anti-receptor antibodies(Blocking antibodies) were tested with PathHunter® U2OS cells expressing Erb1  (93-0681C3) . A dose dependent inhibition can be observed.
(A) PathHunter® U2OS cells expressing TrkA(93-0462C3) can also be used to profile anti-ligand antibodies. The data demonstrates agonist dose response and anti-ligand antibody’s inhibitory response.
(B) PathHunter® TrkA, TrkB and TrkC cells can be sued to identify, screen or profile small molecue inhibitors.

DiscoverX社のPathHunter®非受容体型チロシンキナーゼ（Cytosolic Receptor Kinase Assay）は、サイトカイン受容体や細胞質チロシンキナーゼに対するセルベースアッセイです。
サイトカイン受容体の多くは、受容体型チロシンキナーゼとは異なりキナーゼ活性を有しておらず、JAKなどの細胞内チロシンキナーゼと非共有結合で会合します。インターロイキンやプロラクチン、レプチン、エリスロポエチン、スロンボポエチン、G-CSFなどの受容体は、非受容体型チロシンキナーゼであるJAKによりリン酸化されます。これらのキナーゼは、自己免疫や癌に関わるいくつかのシグナル経路を介しているため、JAK阻害剤もしくは直接的な下流因子であるSTAT阻害剤は、創薬における新規ターゲットとして期待されています。

Figure.3  PathHunter® Cytosolic Receptor Kinase Assays 原理

【原理】

細胞内ドメインにキナーゼ活性を有しないサイトカイン受容体は、細胞内に酵素を会合させることで、細胞内のシグナル伝達を開始します。シグナル伝達経路の最初のステップでは、リガンド誘導性受容体が多量体となり、受容体に会合している非受容体型チロシンキナーゼが受容体のリン酸化を誘導し、SH2領域を持つ下流シグナル分子がリクルートされます。PathHunter® 細胞ベースアッセイでは、受容体の単量体にPKを標識、SH2ドメインを持つアダプタープロテインにEA融合体タンパク質を付加させ、また、非受容体型チロシンキナーゼを細胞に強制発現させています。

【適用】

• サイトカイン受容体リン酸化の検出
• リード化合物の評価や最適化
• JAKファミリー阻害剤等の同定

(A) Assays for Jak1 and Jak2 were developed using the G-CSFR-SHC1 PathHunter cell line. The G-CSFR is known to couple to both Jak1 and Jak2 kinases. Addtion of the agonist, G-CSF, induces the activation of the expressed kinase resulting in phosphorylation of the target receptor, binding of SHC1 and complementation of the enzyme that is measured using Pathhunter reagents.
(B) CSF3R cell line was incubated with and inhibitors such as staurosporine, Lestaurtinib and Pyridone 6, P6, DBI(JAK Inhibitor 1) and challenged with EC₉₀ of their respective agonists(G-CSR, a know agonist). A dose dependent inhibition was observed indicating that the assay can be used to screen or profile inhibitors against the JAK molecule.
(C) The assay measures CSF3R activation, phosphorylation by JAK2 and interaction between CSF3R, JAK2 and SHC1 proteins in a cell-based assay.
Figure.4 Cytosolic Receptor Kinase Assays 評価例

ターゲットリスト

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