記事ID ： 13006

ヒストン脱アセチル化酵素／SIRT活性を超特異的に測定 CHEMILUM DE LYS® HDAC アッセイ（化学発光）

メーカー名：Enzo Life Sciences,Inc.

CHEMILUM DE LYS® アッセイは、組織・細胞・核抽出物中、免疫沈降物もしくは精製酵素中の HDAC/Sirtuin 活性を測定するように簡単な3ステップからなるアッセイシステムです。

UV・青色領域付近に吸収・放出波長を持つ化合物の蛍光による干渉を回避でき、また、ルシフェラーゼフリーの反応系なのでルシフェラーゼ活性をもつ化合物の干渉も回避できます。また、蛍光基質での反応系では Sirtuin を活性化させますが、ネイティブなペプチドでの反応系では活性化を示さない化合物がいくつか確認されています。しかし、この CHEMILUM DE LYS® 基質はナチュラルな基質に、より類似しているので、そのような化合物やレスベラトロールによる基質特異的活性はありません。

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特長

偽陽性・偽陰性がない超特異的アッセイ（表1）
細胞抽出洗浄剤による干渉がない優れたシグナル／ノイズ比
バリデートしたシステムによる一貫した結果

表1　CHEMILUM DE LYS® アッセイでは偽陽性が認められない
	CHEMILUM DE LYS®	ルシフェラーゼベースの化学発光アッセイ	比色アッセイ	蛍光アッセイ
	CHEMILUM DE LYS®	競合HDACアッセイ
レスベラトロールによる人為的な活性はない	○	○	×	×
タンパク質阻害剤への耐性	○	×	○	○
キナーゼ阻害剤への耐性	○	×	○	○

構成内容

構成内容	単品販売品番
HeLa細胞核抽出物（ポジティブコントロール）	BML-KI140-0100
CHEMILUM DE LYS® 脱アセチル化酵素基質	-
CHEMILUM DE LYS® Developer 濃縮	-
トリコスタチンA（HDAC阻害剤）	BML-GR309-0001 BML-GR309-0005
NAD+（Sirtuin 基質）	BML-KI282-0500
ニコチンアミド（Sirtuin阻害剤）	BML-KI283-0500
Sirtuin アッセイバッファー	BML-KI286-0020
Developer バッファー	-
CHEMILUM DE LYS® ENHANCER part A	-
CHEMILUM DE LYS® ENHANCER part B	-
1/2容量白色マイクロプレート	-

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用途

組織・細胞抽出物／免疫沈降物／精製酵素の HDAC 活性をトータルに測定
様々な条件下での HDAC のカイネティクス解析
添付のコントロール HeLa 核抽出物を使った阻害剤活性

製品データ

図1 ルシフェラーゼベースアッセイでみられる干渉を削除
化合物 PTC124 は ATP 存在下でルシフェラーゼによって高親和性の多基質付加体阻害剤、PTC124-AMP に変換されます。1 μM よりも高濃度の PTC124 ではルシフェラーゼベースのアッセイを阻害するが、CHEMILUM DE LYS® アッセイでは影響がない。

図2 界面活性剤への低干渉
各サンプル（HeLa 核抽出物、酵素なし、0.1% CHAPS 処理済み 1.5×10ˆ5 3T3 細胞）で本アッセイを行った。HDAC 反応はトリプシン処理に続き、25 μM CHEMILUM DE LYS® 基質（37℃、60分）で行われた。

図3 高い再現性による一貫した結果
一貫性の評価として Z'-factor 解析を行った。HeLa 核抽出物（40）（赤色の四角）、バッファー（青色のひし形）を、25 μM CHEMILUM DE LYS® 基質を加え、24℃、120分インキュベートした。反応をマニュアルに記載されている通りに停止した。
エンハンサーを加え、化学発光を計測した。
破線は標準偏差を示す。