AAT Bioquest社 フローサイトメトリー試薬

フローサイトメトリーの近代的な発展と、新規蛍光標識の出現とが相まって、細胞生物学、免疫学、微生物学、ならびに癌および臨床研究研究におけるこれまでにないレベルの分析が可能になりました。これらのツールにより、細胞表面マーカーおよび分泌マーカー、細胞内標的、酵素活性、核酸含量、アポトーシス、そしてそれ以外の特定の生物学的に重要な形質について、細胞ごとに異なる細胞集団をスクリーニングし、特性評価することができます。 　AAT Bioquest社では蛍光標識およびCD抗体コンジュゲートから、固定可能な生存性色素、細胞増殖色素およびアポトーシスをモニタリングするためのツールに至るフローサイトメトリー試薬の包括的ポートフォリオを提供します。

細胞増殖アッセイや試薬は、細胞増殖や分化研究において不均一な細胞集団内の細胞の健康をモニターするための重要なツールです。これらは、化合物毒性や腫瘍細胞増殖の阻害を調べる医薬開発に広く使用されており、癌の発生を検出できる診断ツールであることが証明されています。フローサイトメトリーでは、増殖を測定するためのアプローチとして、色素希釈アッセイ、ブロモデオキシウリジン (BrdU) の取り込みによる DNA合成測定といった方法があります。

細胞増殖のための色素希釈アッセイ

CFSE や CytoTell™増殖色素は、フローサイトメトリー用の生細胞の細胞増殖試薬です。細胞が分裂するにつれて、蛍光色素は娘細胞間に均一に分布し、その結果、世代を重ねるごとに蛍光強度が徐々に半減します。これらの増殖色素は、数世代にわたり、in vitro および in vivo の両方で、細胞増殖を長期的に追跡するために使用できます。

CFSE (Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) は細胞透過性の緑色蛍光増殖指示薬で、498 nmで励起し、517 nmで蛍光シグナルを発します。この色素は、細胞膜全体に受動的に拡散し、細胞内エステラーゼとの酵素反応によって CFSE の酢酸基が切断され、細胞内のタンパク質に共有結合するアミン反応性カルボキシフルオレセイン、すなわち SE が生成されます。CFSE は 498 nmで励起される緑色蛍光増殖指示薬として依然と広く使用されていますが、注意点として、細胞毒性が強く、細胞からの色素漏出の影響を受けやすく、PE や PE-Texas Redチャネルに波及することが知られています。

細胞増殖用の高性能 CFSE

CytoTell™ は、CFSEに関連する欠点なしに、生細胞の細胞増殖をモニタリングするように設計された一連の細胞透過性蛍光トレーサーです。CytoTell™色素は細胞膜を受動拡散し、細胞内エステラーゼによって加水分解され、細胞内タンパク質のアミンまたはチオール基に共有結合する高蛍光アミン反応性、チオール反応性色素を生成します。細胞毒性は最小であり、色素は数世代の分裂を通して細胞内に十分に保持され、9世代までは CytoTell™ UltraGreen で可視化することができます。CytoTell™ 色素は、7種類のマルチカラー分析が可能で、細胞内ターゲットの固定、透過化には、標準的なホルムアルデヒド含有固定液やサポニンベースの透過性バッファーを使用することができます。

細胞を生細胞から区別・排除することで、細胞集団のよりクリーンな分離と識別が可能になります。アッセイの精度が大幅に向上したことで、試薬が死細胞に非特異的に結合して生じる望ましくないアーチファクトや偽陽性が排除されるようになりました。フローサイトメトリーの読み取り値から生細胞集団と死細胞集団を区別するために、AAT Bioquest では、幅広い Cell Meter™ Fixable Viability 色素、Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining キットを提供しています。標識は安定的かつ堅牢で、固定液や透過性バッファーと互換性があるため、細胞内ターゲットのさらなる分析を可能にします。

Cell Meter™ fixable viability 色素

Cell Meter™ fixable viability 色素 は、フローサイトメトリーで生細胞と死細胞を区別するように設計された膜不透過性生存率色素のファミリーです。これらの色素は、膜の完全性が損なわれた死細胞を容易に透過し、アミンおよびチオールを含むタンパク質や他の細胞内成分に不可逆的に結合するため、それらを分析から簡単に除外できます。染色は堅牢で安定しているため、Cell Meter™ fixable viability 色素で標識された細胞を固定、透過処理をし、細胞内のイムノフェノタイピングを行うことができます。

		図3. CellMeter™染色原理 生細胞は Cell Meter™ fixable viability 色素を排除し、細胞表面のアミンとチオールのみに結合し、蛍光を最小限に抑えます。膜の完全性が損なわれた死細胞は、色素がアミンおよびチオールを含むタンパク質や他の細胞内成分に透過して染色され、強い蛍光を発します。 生細胞と死細胞のシグナル強度の差は大きく、死細胞を分析から簡単に除外できます。

Cell Meter™ fixable viability 色素は 9種の蛍光染色が可能で、マルチカラーパネルデザインの柔軟性を高めます。このシリーズに含まれる色素は、405、488、633、および 647 nm のレーザーラインを持つ励起源によって励起され、一般的なチャネルで蛍光します。

		図4. Cell Meter™ fixable viability 試薬による Jurkat細胞の生存率の検出 Jurkat細胞を CellMeter™ BX590 (品番：22514) で染色した後、3.7 ％ ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。死細胞集団 (青いピーク) は、PE-TexasRedチャネルで生細胞集団 (赤いピーク) と簡単に区別され、固定前後でほぼ同じ結果が得られた。

Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining キット

Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining キットは、膜不透過性のアミン反応性色素を使用して、フローサイトメトリーで生細胞と死細胞を区別します。各キットで提供される色素は、死細胞の損傷した膜に容易に透過し、細胞内および細胞外のアミン含有タンパク質の両方に共有結合して、強い蛍光を発します。生細胞上では、細胞表面のアミン基のみが色素と反応するため、その蛍光シグナルは無視できるほどです。生細胞集団と死細胞集団の間のシグナル強度の違いが重要であり、分析から死細胞を簡単に除外できます。Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining キットを使用して標識された細胞は、細胞内のイムノフェノタイピングのための固定、透過処理が可能です。AAT Bioquest社では、350、405、488、532、561、633、および 647 nm のレーザーラインをもつ励起源によって効率的に励起し、一般的なチャネルで蛍光可能な 10種類の Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining Kits を提供しています。

図5. Liveまたは Live or Dead™ Fixable Dead Cell Staining Kits によるJurkat細胞の生存率の検出
Jurkat細胞をLive or Dead™ Fixable Dead Cell Staining Kits で染色し、3.7 ％ ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。

フローサイトメトリーで DNA含有量の変化を分析することは、細胞周期のさまざまな段階にある細胞を特定するために一般的に用いられる方法です。この技術は、化学量論的にDNAに結合し、細胞内に存在するDNAの量に正比例して蛍光シグナルを生成する DNA結合性蛍光色素を利用しています。細胞が細胞周期の G1期から G2期に進むにつれてDNA密度が増加すると、細胞は DNA含有量が 2倍になるまで比例的に取り込むことになります。その結果、G2期の細胞は G1期の細胞の2倍の明るさで蛍光を発することになります。

AAT Bioquest社では、4種類の細胞周期アッセイを提供しています。そのうち 3種類は生細胞分析用に設計され、残り1種類は固定細胞用に設計されています。CellMeter™蛍光測定生細胞周期アッセイキットは、膜透過性DNA結合色素を利用して、細胞周期の進行と増殖をモニタリングし、細胞周期の速度論的、時間的側面を調べることが可能です。染色後、細胞を固定して透過処理することができます。CellMeter™蛍光固定細胞周期アッセイキットは、当社独自の膜非透過性DNA結合色素 NuclearRed™ CCS1 を使用しています。染色前に、細胞を固定または透過処理して、全ての色素を細胞に取り込ませる必要があります。各キットには、堅牢な染色プロトコルと 200回分のテストに必要なすべてのコンポーネントが含まれています。AAT Bioquest社では、ヨウ化プロピジウム、7-AAD、DAPI、Hoechst 33342、33258、S769121、34580、TWO-PRO™1およびTWO-PRO™3など、細胞周期分析用のDNA結合色素も提供しています。

図6. 増殖中およびノコダゾール処理した Jurkat細胞におけるDNAプロファイル urkat細胞を何も添加しない (A)、あるいは 100 ng/ml ノコダゾール添加 (B) し、37 °C、5 ％ CO2インキュベーターで24時間培養し、その後 Nuclear Green™ LCS1 で 30分間反応させた。Nuclear Green™ LCS1 の蛍光強度は、FITCのチャネルをセットした ACEA NovoCyte フローサイトメーターで測定した。増殖中の Jurkat細胞 (A) では、Nuclear Green™ LCS1で染色された核は、G1、S、および G2期を示した。ノコダゾールで処理された G2停止細胞 (B)では、G2細胞の頻度が劇的に増加し、G1、S期の頻度が大幅に減少した。

フローサイトメトリーは、アポトーシスの複雑さを研究するための最も汎用的でハイスループットなアプリケーションの1つです。複雑な細胞集団から個別に細胞を分析できるようにするだけでなく、フローサイトメトリーのマルチパラメトリックな性質により、いくつかのアポトーシス指標とマーカーを同時に調べることができます。フローサイトメトリーアポトーシスアッセイの幅広い選択により、原形質膜コンフォメーションの変化、ミトコンドリア膜電位の喪失、カスパーゼの活性化、核凝縮を調べます。もしくはマルチパラメトリックアポトーシス解析のためにいくつか技術を組み合わせて利用します。

フローサイトメトリーによるアポトーシスの検出のためのアネキシンVアッセイ

アネキシンVコンジュゲートは、初期アポトーシスの重要な特徴であるホスファチジルセリン (PS) 残基の外在化を調べるために日常的に使用されています。細胞がプログラム細胞死を開始すると、細胞膜の非対称性が失われ、PS残基が原形質膜の内側から外側に移動します。細胞表面の PS残基の露出は、アネキシンVに対する親和性により検出が可能で、蛍光標識されたアネキシンVコンジュゲートを使用してフローサイトメトリーでアポトーシス細胞を同定することができます。

CellMeter™アネキシンV結合アポトーシスアッセイキットは、PS残基の外在化に基づいてアポトーシス細胞を測定する迅速で信頼性の高い方法を提供します。これらのキットは、高い蛍光性のアネキシンVコンジュゲートと膜不透過性のDNA染色を利用して、生細胞、死細胞、アポトーシス細胞を区別します。このようにして、生存可能な細胞はほとんど、または全く蛍光を示さず、初期アポトーシスの細胞はアネキシンVコンジュゲート蛍光を示し、死細胞は膜不透過性DNA染色およびアネキシンVコンジュゲートの二重標識を示します。これらのキットは、細胞の生存率とアポトーシスのマルチパラメトリック研究のために他の試薬と組み合わせることができます。

CellMeter™アネキシンV結合アポトーシスアッセイの主な機能

• 高感度：iFluor™ または mFluor™色素で標識されたアネキシンV は、AlexaFluor® および他のスペクトル的に類似したアネキシンVコンジュゲートよりもはるかに明るく光安定性の高いシグナルを生成します。
• 柔軟性：あらゆる機器のセットアップに適合するスタンドアロンのアネキシンVコンジュゲートまたは豊富な使いやすいアッセイキット
• 便利なアッセイデザイン： 30〜60分で完了することができる合理化されたプロトコル

図7. Jurkat細胞におけるホスファチジルセリンへのアネキシンV-mFluor™ Violote 450コンジュゲートの結合活性検出 Jurkat細胞を何も添加しない (青)、もしくは 1 µMスタウロスポリン (赤) を添加し、37°Cで4時間処理した後、AnnexinV-mFluor™ Violet 450コンジュゲートで30分間処理した。Pacific Blue チャネルをセットした ACEA NovoCyteフローサイトメーターで蛍光強度を測定した。

フローサイトメトリーによるミトコンドリア膜電位アッセイ

ミトコンドリア膜電位の喪失は、アポトーシスの初期段階の特徴です。フローサイトメトリーでは、膜透過性カチオンプローブを使用して、ミトコンドリア膜電位の変化をリアルタイムで識別し、アポトーシス細胞を生細胞集団から区別することができます。AAT Bioquest社では、ミトコンドリア膜電位を観察するめに設計された試薬と動的アッセイの幅広い選択肢を提供しています。これらには、JC-10™、シングルエミッションインジケーター、フローサイトメトリーアプリケーション用に最適化された CellMeter™ミトコンドリア膜電位アッセイキットなどのレシオメトリックインジケーターがあります。

JC-10™

AAT Bioquest社の JC-10™ は、従来の JC-1 よりも高い精度と感度でミトコンドリア膜電位を監視するように設計された新しいレシオメトリックインジケーターです。JC-1 と同様に、JC-10™は 電位依存的な蓄積を示します。健康な細胞では、JC-10™はミトコンドリアに選択的に蓄積し、広い励起スペクトルと 590 nm で最大蛍光を示すオレンジ色の J凝集体を生成します。逆に、ミトコンドリア膜電位が低いアポトーシス細胞や壊死細胞では、JC-10™ がミトコンドリアから拡散し、JC-10™モノマーが生成され、緑色発光 (525 nm) にシフトします。JC-10™ はミトコンドリア膜電位の変化を、オレンジ色から緑色蛍光放射へのシフト、またそれぞれの蛍光強度比から、定性的、定量的な視覚化を可能にします。JC-10™色素は、スタンドアロン試薬として、または Cell Meter™ JC-10 Mitochondrion Membrane Potential Assay Kit *Optimized for Flow Cytometry Assays* の構成品として入っています。

【JC-10™およびCellMeter™JC-10™アッセイキットの主な機能】

• 使いやすさ：JC-10™ は水性緩衝液に希釈しても沈殿せず、アーチファクトを排除します。
• 堅牢性：JC-10™ は、水性培地への溶解性が向上し、感度が高いため、アッセイの偏差が小さくなります。
• 強化シグナル：JC-10™ は、JC-1 よりも高いシグナル/バックグラウンド比を有します。
• 感度の向上：JC-10™ は、試験したすべての細胞株で、JC-1よりも ΔΨm損失の微妙な変化を検出する機能を備えています。

図8. Jurkat細胞におけるFCCP誘導性ミトコンドリア膜電位変化の検出 Jurkat細胞に DMSO (上) もしくは 20 µM FCCP (下) で溶解したJC-10 染色溶液を加え10分間反応させた。JC-10 の J-凝集体及び単量体の蛍光強度を、FL1およびFL2 チャネルをセットした FACSCalibur™ flow cytometer (Becton Dickinson) で測定した。補正されていないデータ (左の列) を補正されたデータ (右の列) と比較した。

単一発光ミトコンドリア膜電位色素

ミトコンドリア膜電位の変化を動的にモニターできる他の試薬やアッセイとして、TMRE や TMRM の他、オレンジ、赤、近赤外蛍光でのモニターが可能な Cell Meter™ミトコンドリア膜電位アッセイキットがあります。ミトコンドリアが機能している健康な細胞では、こういった膜透過性色素は、活性のあるミトコンドリアによって容易に隔離され、明るい蛍光を発します。ミトコンドリア膜電位が崩壊すると、蓄積が止まり、色素が細胞質全体に放出され蛍光が失われます。

図9. Jurkat細胞での CCCP処理に応答した MitoTell™Red の蛍光強度の減少 Jurkat細胞に MitoTell™ Redのみ (青)、20 µM MCCP (緑) または 50 µM CCCP (赤) の存在下で30分間反応させた。MitoTell™ Red の蛍光強度は、APCチャネルをセットした ACEANovoCyteフローサイトメーターで測定した。

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