パラフィン包埋切片の免疫組織化学染色／検出用のセット品 IHC発色キット（HRP標識抗ウサギ抗体ポリマー試薬&基質入り）

ウサギ一次抗体用IHC発色キット（IHC Detect Kit for Rabbit Primary Antibody）は、パラフィン包埋（FFPE）切片サンプルを用いた免疫組織化学（IHC）染色実験に最適化されたウサギ一次抗体検出キットです。

キット構成品としてHRP標識抗ウサギIgG二次抗体ポリマー試薬、発色基質（成分A、成分B）、クエンチングバッファーおよび一次抗体希釈液が付属します。IHC発色キットには非特異的バックグラウンドを低減する一次抗体希釈液も含まれており、60スライド分^※の高感度なIHC検出を可能にします。

※ 組織切片スライドの大きさによって添加する試薬量が異なるため、1キット（60 tests）で染色可能な最大スライド数は異なります。

［関連商品］IHC発色キット（HRP標識抗マウス抗体ポリマー試薬&基質入り）
［関連商品］IHC発色キット（HRP標識抗ウサギ／マウス抗体ポリマー試薬&基質入り）

• 最小限の免疫組織化学（IHC）検出用試薬を含むシンプル&ミニマルなキット
• 二次抗体ポリマー試薬で高感度なIHC検出を実現
• キット付属の一次抗体希釈液でバックグラウンドを低減
• 組織切片の内因性ペルオキシダーゼ活性除去にクエンチングバッファーも付属
• 1キットで60スライド^※を染色可能

※ 組織切片スライドの大きさによって添加する試薬量が異なるため、1キット（60 tests）で染色可能な最大スライド数は異なります。

■ ウサギ一次抗体用IHC発色キット（品番：PK10009）を使用した免疫組織化学の染色例

図1
TDP-43リコンビナントウサギモノクローナル抗体（品番：80001-1-RR）を用いたヒト神経膠腫組織のIHC染色結果。IHC染色はウサギ一次抗体用のIHC発色キット（品番：PK10009）を使用して実施されました。

図2
IBA1ウサギポリクローナル抗体（品番：10904-1-AP）を用いたヒト扁桃炎組織のIHC染色結果。IHC染色はウサギ一次抗体用のIHC発色キット（品番：PK10009）を使用して実施されました。

■ IHC発色キット（HRP標識抗ウサギ抗体ポリマー試薬）の参考資料

• ［マニュアル］IHC Detect Kit for Rabbit Primary Antibody

■ 操作手順

1. 標準的方法に従って免疫組織化学（IHC）染色用の組織切片スライドを準備します。スライド上のパラフィン包埋（FFPE）切片をキシレンで脱パラフィン後、濃度を徐々に低くしたエタノール系列を使用して再水和します。
2. 適用する一次抗体製造メーカーの推奨方法で抗原賦活化を行ってください。
3. クエンチング^※（オプション）：
   1. 洗浄バッファー（1x）でスライドを洗浄します。洗浄後にスライド上の液体を除去します。組織切片周辺の残液をペーパータオル等を使いできる限り除去してください。「撥水性ペン（Hydrophobic IHC pen）」を使用し、組織切片を囲むように円を描くことで撥水性サークルを形成します（オプション）。
   2. クエンチングバッファー（構成品番号：HC000）30〜80 µLをスライド上に滴下してください（組織全体を覆う程度の量を添加してください。組織の大きさによって添加量を調整できます）。スライドを室温で10分間静置し、クエンチング後に洗浄バッファー（1x）でスライドを洗浄します。
   ※ 内因性ペルオキシダーゼのクエンチング操作については、プロテインテックラボのIHC検証では多くの場合実施していません。しかしながら、様々な文献や各種プロトコールにクエンチング操作が含まれているため、本キットにもクエンチング試薬を同梱しています。なお、クエンチング操作は染色性を低下させる場合もあるため個別にご検討する必要があります。
4. ブロッキングバッファー^※（例. 3％ BSA in PBS）を用いて、室温で30分間ブロッキング操作を実施します。ブロッキング後、スライド上の液体を除去します。組織切片周辺の残液をペーパータオル等を使い除去してください。
   ※ 一次抗体希釈液（構成品番号：HC004）をブロッキングバッファーとして使用することもできます。
5. 一次抗体希釈液（構成品番号：HC004）を使用し、ウサギを宿主として産生された一次抗体を希釈します。希釈済み一次抗体80〜200 µLをスライド上に滴下してください（組織全体を覆う程度の量を添加してください。組織の大きさによって添加量を調整できます）。蓋つきの湿潤箱にスライドを静置し、室温で1時間インキュベートします。
6. インキュベート後、洗浄バッファー（1x）でスライドを3回洗浄します。洗浄後にスライド上の液体を除去します。組織切片周辺の残液をペーパータオル等を使い除去してください。HRP標識ヤギ抗ウサギ抗体ポリマー試薬（構成品番号：HC005R）30〜80 µLをスライド上に滴下してください（組織全体を覆う程度の量を添加してください。組織の大きさによって添加量を調整できます）。蓋つきの湿潤箱にスライドを静置し、室温で30分間インキュベートします。
7. インキュベート後、洗浄バッファー（1x）でスライドを3回洗浄します。洗浄後にスライド上の液体を除去します。組織切片周辺の残液をペーパータオル等を使い除去してください。
   マイクロチューブ内で発色剤成分A（構成品番号：HC006）と発色剤成分B（構成品番号：HC007）を1:20の比率で混合し、発色基質を調製します。調製後の発色基質30〜80 µLをスライド上に滴下してください（組織全体を覆う程度の量を添加してください。組織の大きさによって添加量を調整できます）。
8. 発色基質を添加後、スライドを平らな台の上に室温で静置してください。茶色のシグナルが現れるまで（約5分間程度）インキュベートしてください。発色後、洗浄バッファー（1x）で洗浄することで、速やかに反応を停止させます。
9. 必要に応じて、ヘマトキシリンで対比染色を行います。
10. スライドを洗浄バッファー（1x）または純水で洗浄します。濃度を徐々に高くしたエタノール系列、キシレンを使用して組織切片を脱水します。その後、スライドカバーとマウンティング剤を用いて組織切片を封入します。完全に乾燥させた後に光学顕微鏡で観察します。

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