最高輝度を誇るカルシウムインジケーター カルシウム指示薬 Calbryte™ シリーズ

1989年にFluo-3が紹介されて以降、シグナル/バックグラウンド比が改善されたFluo-4、Fluo-8、およびCal-250®が開発され、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリ、およびハイスループットスクリーニングアプリケーションにおいてCa²⁺指示薬として広範に使用されてきました。しかし、Fluo-4にはいくつかの深刻な問題があります。例えば、Fluo-4 AMを使用したほとんどの細胞内カルシウムアッセイでFluo-4の細胞外漏出を防ぐためにプロベネシドを添加する必要があります。プロベネシドは様々な細胞への影響をもつことが知られており、プロベネシドを使用してFluo-4 を基盤としたカルシウムアッセイを行うことでアッセイ結果に問題が生ずる可能性があります。 Calbryte™ 520 AMは新規の蛍光かつ細胞透過性カルシウム指示薬で、他のAM色素の細胞導入と同様に、Calbryte™ 520 AMエステルは非蛍光ですが、細胞に入ると細胞内エステラーゼによる加水分解を受けて活性化されます。活性化された指示薬は極性分子となり細胞膜を自由に透過できなくなり、主に細胞内に蓄積されます。Calbryte™ 520は、Ca²⁺イオンに結合すると非常に高いシグナル/バックグラウンド比をもつ明るい蛍光シグナルを産生します。さらに、Calbryte™ 520は細胞内保持率が著しく改善されています。Fluo-4と同一の励起と発光波長をもつため、Fluo-4アッセイ設定と同じ設定をそのままCalbryte™ 520を利用するカルシウムアッセイに利用できます。Calbryte™ 520は、細胞内カルシウム測定用の次世代型蛍光指示薬で、シグナル/バックグラウンド比と細胞内保持特性が非常に改善されていることから、生細胞内におけるGPCR やカルシウムチャネル標的の評価を始め、そのアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングに適しています。

図.4 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K1細胞を96穴の黒壁/澄明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。プロベネシドを添加したFluo-4 AM (Cat# 20551) またはCalbryte AM (Cat# 20651) のHHBS溶液を100 µLずつ細胞に添加し、37℃で45分間培養した。色素導入溶液を200 µL HHBSと置換し、50 µLの50 µM ATPを添加した。細胞は蛍光顕微鏡（Keyence）のFITCチャネルを用いてイメージングした。

Calbryte™ 590は、Calcium Orange™ や Rhod-2といったAAT Bioquest社の橙赤蛍光指示薬の性能を高めたものです。この色素の最大励起波長は580 nmであり、555 nmレーザー線で良好に励起します。最大発光波長は592 nmであり、TRITC/Cy3®フィルターセットと互換性があります。Calbryte™ 590は、同様条件下でRhod-2に比べてカルシウムに対しおよそ10倍高感度です。さらに、ミトコンドリアに主に局在するPhod-2と異なりCalbryte™ 590は細胞基質に良好に保持されます。

図.5 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K細胞を96穴の黒壁/透明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。2 mM プロベネシドとHHBSに溶解したCalbryte™ 590 AM (Cat# 20701) を100 µL細胞に添加し、37℃で1時間培養した。その後、色素導入溶液を200 µL HHBSと置換した。細胞は50 µLの50 µM ATPを添加前後において、蛍光顕微鏡（Keyence）のTRITCチャネルを用いて画像化した。

Calbryte™ 630は、X-Rhod-1といった赤&深紅蛍光指示薬の性能を高めたものです。この色素は最大励起波長608nmをもち、594nmレーザー線と良好に一列に並びます。この色素の最大八稿波長は624nmであり、一般的なTexas® Redフィルターセットと互換性があります。スペクトルの緑色領域と離れているため、Calbryte™ 630は iFluor™ 488、Alexa Fluor® 488、またはGFPといった緑色蛍光標識とのマルチプレックスに適しています。さらに、Calbryte™ 630は長波長の発光であるため、組織深層部の研究に適しています。これは波長が長い色素ほど数々の細胞層を浸透しやすく、短波長色素では浸透しにくいためです。

図.6 CHO-K1細胞における内在性P2Y受容体のATP応答
CHO-K細胞を96穴の黒壁/透明底コースタープレートの各ウェルに40,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。細胞に、2 mM プロベネシドとHHBSに溶解したCalbryte™ 630 AM (Cat# 20721)を100 µL添加し、37℃で1時間培養した。その後、色素導入溶液を200 µL HHBSで置換した。細胞に50 µLの50 µM ATPを添加した後、蛍光顕微鏡（Keyence）のTexas Red®チャネルを用いて画像化した。