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dNTPアナログによるランダム変異を導入 JBS dNTP-Mutagenesisキット

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メーカー名：JENA BIOSCIENCE GMBH

JBS dNTP-Mutagenesisキットは、dNTPアナログによってランダム変異をDNA断片に導入するキットです。

背景

30億年にわたる進化の中で、自然界はランダム変異を繰り返すことで多数のタンパク質を創出し、コードしたタンパク質の優秀な機能をin vivoで選択してきました。この自然進化の例が、研究者をここ20年におけるin vitroタンパク質組換え戦略の躍進に導いてきました。

数多く適応された戦略の中から、3種の主要で強力な技術が出現しました。そのひとつが、本キットに応用されている「dNTPアナログによるランダム変異」による方法です。

この方法は8-オキソ-dGTPやdPTPのような変異原性dNTPアナログをPCRによるDNA断片の増幅に組み込むことに基づきます。変異原性dNTPは4種の天然型dNTPのみ含むセカンドPCRステップにより除去され、変異率は20%に上ります。

使用目的

dPTP同様8-オキソ-dGTはTaqを用いたPCRによりDNAに組み込まれる変異原性dNTPアナログです（Zaccolo et al., Zang et al.）。
8-オキソ-dGTPはアデニンの相補鎖側に取り込まれるため、AをC、TをGという2種類の置換変異を起こします。AからC : TからGの比が約1: 1.5で、合計2%の変異が確認されています（図2）。

図1 dPTPと8-オキソ-dGTPの構造

dNTPアナログであるdPTPは8-オキソ-dGTPの10倍近い変異原性を示すことが報告されています（図2）。dPTPにより誘発される変異はAからG、TからC、GからA、CからTが、それぞれ5: 4: 1: 1の割合で、合計19%の割合で生じます。
8-オキソ-dGTPまたはdPTPによって誘発されるランダム変異は、2回のPCR工程により行われます。初めに、4種の天然型dNTPに変異原性アナログであるdPTPまたは8-オキソ-dGTPの存在下でターゲットDNA断片の増幅を行います。変異率はPCRのサイクル数により簡単に調節できます（図2）。

図2 PCRサイクル数に対する変異率（Zaccolo et al.）

ファーストPCR産物を、変異原性アナログを含まないセカンドPCRにかけます。この操作でクローニングや形質転換を行う前にターゲットDNAから非天然型アナログを除去します。

参考文献

Cadwell and Joyce (1992) Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Meth. Appl. 2:28
Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 370:389
Zaccolo et al. (1996) An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues. J. Mol. Biol. 255:589
Zaccolo et al. (1999) The effect of high-frequency random mutagenesis on in vitro protein evolution: a study on TEM-1 beta-lactamase. Journal of Molecular Biology 285(2):775
Crameri et al. (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution. Nature 391:288
Zang et al. (2006) Efficient and high fidelity incorporation of dCTP opposite 7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanosine by Sulfolobus solfataricus DNA polymerase Dpo4. Journal of Biological Chemistry 281:2358