乳製品や生体試料（血液や尿）中のラクトース量を蛍光定量 ラクトース測定アッセイ（Lactose Assay）

ラクトース測定アッセイキットは、食品（乳製品）や生体試料（哺乳動物の血液や尿など）中のラクトース量を蛍光測定する簡便なアッセイです。

サンプル中のラクトースは、最初にラクターゼ酵素によってガラクトースとグルコースに分解されます。その後、得られたグルコースをグルコースオキシダーゼで酸化して生成される過酸化水素を蛍光プローブで検出します。本製品は、96ウェルプレートフォーマットで100アッセイ分の試薬を含みます。 

ラクトース（Lactose）とは？

ラクトース（Lactose）は、グルコース1分子とガラクトース1分子の単糖からなる二糖類です。ラクトースは、乳糖とも呼ばれ、天然では牛乳等の乳中にミリモル濃度レベルで存在しています。ラクトースは、摂取後に小腸から分泌される酵素ラクターゼによってグルコースとガラクトースに分解され、血中に取り込まれます。

ラクトースを消化することができないことは「ラクトース（乳糖）不耐症」として知られ、その原因としてラクターゼ酵素の減少や欠損から生じる「ラクターゼ欠乏症」が一般的に知られています。このラクターゼ欠乏症は、ほとんどの哺乳動物においては正常な状態であり、生後間もない動物が主要な栄養源とする母乳からの離乳後に発症します。一方ヒトの場合では、大人になっても小腸内でラクターゼが継続的に生産され、ラクトースに耐性を持つ集団が非常に多く存在します。いくつかの推定は、世界の75%の成人人口がラクターゼ欠損であることを示唆しています。

ラクトース消化不良症状の重症度は摂取するラクトース量に依存するため、様々な乳製品中のラクトース相対量を定量化することが重要になります。

• 乳製品サンプルやその他生物学的サンプル（血清、血漿、尿、細胞/組織ライセート、細胞培養上清）に適用
• 検出限界：約10μM ラクトース
• ラクトーススタンダード付属

• ラクトーススタンダード
• 10X アッセイバッファー
• 蛍光プローブ
• HRP
• ラクターゼ酵素
• グルコースオキシダーゼ

サンプル中のラクトースは、最初にラクターゼ酵素でグルコースとガラクトースに分解されます。続いて、グルコースをグルコースオキシダーゼによって酸化し、D-グルコン酸と過酸化水素を生成します。得られた過酸化水素は、その後、特異性の高い蛍光プローブを用いて検出されます。プローブと過酸化水素は1:1で結合し、HRP（Horseradish peroxidase）がその反応を触媒します。

サンプルおよびスタンダードを45分間インキュベートし、次いで、標準的な96ウェル蛍光プレートリーダーで測定します。サンプル濃度は、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット内のラクトーススタンダードと比較して算出されます。

図1. ラクトースアッセイの原理

※サンプル中の内在性グルコースがアッセイに干渉する場合があるため、内在性コントロールを置いての実験を推奨します。

1. キット使用前に全ての試薬を混合、調製してください。
   （サンプルおよびスタンダードの各試料はデュプリケートまたはトリプリケートでのアッセイを推奨します。）
2. スタンダード50 μLを、蛍光プレートリーダー適合の黒色96ウェルプレートに添加します。
3. サンプル50μLを、異なる2ウェルに加えます。
4. 「反応液ミックス（(+)ラクターゼ）」50 μLを、全てのスタンダードウェルと、2つのサンプルウェルの片方に加えます。
5. 「内在性コントロールミックス（(-)ラクターゼ）」50 μLを、もう一方のサンプルウェルに加えます。
6. よく混合し、遮光、37℃の条件で45〜90分間インキュベートします。
   Note：このアッセイは、連続したものですが、反応速度に応じて複数の時点で測定できます。
7. 蛍光マイクロプレートリーダーでプレートを測定します（励起：530-570 nm、蛍光：590-600 nm）。
8. 反応液ミックスを添加したサンプル（ステップ4）のRFU値と、内在性コントロールサンプル（ステップ5）のRFU値の差を求めます。
9. サンプルのRFU値とスタンダードカーブを比較することで、サンプル内のラクトース濃度を計算します。

図2. ラクトーススタンダードカーブ

図3. ウシ脱脂粉乳中ラクトースの検出

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