記事ID ： 10637

多発性硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡などの自己免疫疾患研究に有用 PAD活性測定アッセイキット

メーカー名：ImmunoPrecise Antibodies B.V. (Former ModiQuest Research B.V.)

本商品は、細胞または組織ライセート中のPAD酵素（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ：タンパク質中のアルギニン残基を脱イミノ化してシトルリンに変換する酵素）の活性を測定するためのELISAキットです。

リコンビナントPAD酵素と組み合わせて使用することで、PAD阻害分析を行うこともできます。

構成内容

アルギニンを含むペプチドでコートした96ウェルELISAプレート（各ストリップ中の最後のウェルはポジティブコントロールとして脱イミノ化されたアルギニンを含むペプチドでコートされています）
ヒトPAD酵素（活性校正用）
脱イミノ化バッファー
マウス脱イミノ化アルギニン抗体
HRP標識抗マウスIgG抗体

操作概要

事前に96ウェルプレートに脱イミノ化バッファーを加え、プレートを37℃で30分間プレインキュベートします（プレートの平衡化を行います）。
プレート上の液を捨て、氷上に配置します（脱イミノ化バッファーも氷上に配置します）。
サンプルのライセートとスタンダード用のPAD 酵素を、冷却した脱イミノ化バッファーで希釈します。
(3)で調製したサンプルとスタンダードを氷上でプレートに加えます。
プレートを75分間、37℃の加湿チャンバー内でインキュベートします。
プレートを洗浄バッファー（PBS＋0.05％Tween-20、キットに含まれません）で洗浄します。
HRP標識抗脱イミノ化アルギニンモノクローナル抗体を1％BSA入りの洗浄バッファーで希釈し、ウェルに分注します。
プレートを37℃の加湿チャンバー内で、1 時間インキュベートします。
プレートを洗浄バッファーで洗浄します。
TMB 基質（キットに含まれません）をウェルに加え、青色になるまで室温でインキュベートします。
2M硫酸を加え、反応を停止させます。
450nmの吸光度を測定します。

使用例

PAD酵素活性｜PAD活性アッセイキット
図1　PAD酵素活性
アルギニンを含むぺプチドでコートされたプレートに、様々な濃度のヒトリコンビナントPAD酵素を添加した。酵素濃度の増加に伴い、検出されるシトルリンペプチドの量が増加した。また、EDTAの添加により、カルシウムイオンが枯渇し、PAD酵素の活性が抑制された。

組織ライセート中のPAD活性｜PAD活性アッセイキット
図2　組織ライセート中のPAD活性
マウスの各種組織中のPAD活性を、EDTA添加有（カルシウム不含有コントロール）、無（カルシウム含有）の条件で測定した。

PAD活性測定アッセイキット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
PAD Enzyme Assay	MDQ	MQ 17.101	96 ASSAY	￥260,000

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単位の定義
：1ユニットは、55℃、pH7.2で、1時間当たり、BAEE（ベンゾイルＬ－アルギニンエチルエステル；PAD酵素の基質）から1μモルのＮ-α-ベンゾイルシトルリンエチルエステルを生成する単位
活性
：PAD活性キット（品番MQ-17.101）を用いて、シグマアルドリッチ社製のウサギ骨格筋PADの活性と比較して算出
Hisタグ
：Ni-ビーズによる精製済み

リコンビナントPAD酵素