無機リン酸（Pi）を定量的に検出 リン酸測定アッセイ（蛍光）

本製品は、96ウェルプレートフォーマットで、溶液、食品、細胞／組織ライセートサンプル中の総無機リン酸（Pi）量を測定する簡便な蛍光アッセイです。各キットにはブランク、リン酸スタンダード、内在性コントロール、未知サンプルを含む1000アッセイ分の試薬が含まれます。

リン酸（Phosphate）について

遊離の可溶性リン酸塩として存在するリンは、無機リン酸（Pi／inorganic phosphate）と呼ばれ、アミノ酸代謝、タンパク質活性化、炭素代謝、細胞シグナリング、およびエネルギー移動などの多くの生物学的プロセスの調節に重要です。また、ATP、核酸、リン脂質、およびタンパク質の生合成にも使用されます。

• ライセート、溶液、食品、その他生物学的サンプルに適用
• 検出限界：1.56μM リン酸
• リン酸スタンダード付属

• リン酸スタンダード
• 10X アッセイバッファー
• 蛍光プローブ
• HRP
• マルトース
• マルトースホスホリラーゼ
• グルコースオキシダーゼ

本製品は、溶液、細胞培養上清、ライセート、食品サンプル中の総無機リン酸塩量を蛍光測定します。

無機リン酸（Pi）が存在すると、キットに含まれるマルトースは、マルトースホスホリラーゼ酵素によってグルコース-1-リン酸とグルコースに変換されます。続いて、グルコースがグルコースオキシダーゼによってD-グルコン酸と過酸化水素に変換されます。得られた過酸化水素は、その後特異性の高い蛍光プローブを用いて検出されます。プローブと過酸化水素は1:1で結合し、HRP（Horseradish peroxidase）がその反応を触媒します。

サンプルおよびスタンダードを3時間インキュベートし、次いで、標準的な96ウェル蛍光プレートリーダーで測定します。サンプル濃度は、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット内のリン酸スタンダードと比較して算出されます。

図1. リン酸測定アッセイの原理

※サンプル中の内在性グルコースがアッセイに干渉する場合があるため、内在性コントロールを置いての実験を推奨します。

1. キット使用前に全ての試薬を混合、調製してください。
   （サンプルおよびスタンダードの各試料はデュプリケートまたはトリプリケートでのアッセイを推奨します。）
2. スタンダード50 μLを、蛍光プレートリーダー適合の黒色96ウェルプレート添加します。
3. サンプル50μLを、異なる2ウェルに加えます。
4. 「反応液ミックス（(+)マルトースホスホリラーゼ）」50 μLを、全てのスタンダードウェルと、2つのサンプルウェルの片方に加えます。
5. 「内在性コントロールミックス（(-)マルトースホスホリラーゼ）」50 μLを、もう一方のサンプルウェルに加えます。
6. よく混合し、遮光・37℃の条件で3時間インキュベートします。
   Note：このアッセイは、連続したものですが、反応速度に応じて複数の時点で測定できます。
7. 蛍光マイクロプレートリーダーで測定します（励起：530-570 nm、蛍光：590-600 nm）。
8. 反応液ミックスを添加したサンプル（ステップ4）のRFU値と、内在性コントロールサンプル（ステップ5）のRFU値の差を求めます。
9. 測定サンプルのRFU値とスタンダードカーブを比較することで、サンプル内のリン酸濃度を計算します。

図2. リン酸スタンダードカーブ

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