I 型・III 型コラーゲンを染色するキット Picrosirius Red Stain Kit

Picrosirius Red Stainは、様々な直径のコラーゲン線維に特異的に結合し、I型およびIII型コラーゲンを区別できます。

コラーゲン構造は、明るい赤色に染色されます。ヘマトキシリン・エオシン単独染色では不明瞭な、象牙質細管、シャーピー繊維とその他の構造を明確に観察できます。また、偏光顕微鏡下で、コラーゲンのタイプを特定することができます（I型：黄色、III型：緑）

小分子の黄色のピクリン酸色素は、陰イオン性で、わずかに疎水性を持ちます。また、高分子のシリウスレッドは親水性で、陽イオン性の金属錯塩染料と結合し、コラーゲン線維及びその関連組織を染色するメカニズムの基礎となっています。まず、酸性色素に耐性のあるワイゲルトヘマトキシリンのような金属錯塩染料により核と細胞質を染色します。次の染色ステップで、コラーゲンを赤く、細胞質及びその他のタンパク質が多い組織を黄色に染色します。染色パターンは、色素分子の大きさによる速度よってコントロールされ、大きいと浸透性の部位（コラーゲン線維）を拡散するのが遅くなります。染色速度を増加させる固定剤を使用すると切片はより赤く染色され、厚い切片は薄い切片より黄色く染色されます。選択性は、染色時間、温度、固定、切片の厚さ、pHなど様々な要因の影響を受けます。

• 溶液A：リンモリブデン酸
• 溶液B：ピクロシリウスレッド F3BA 染色液
• 溶液C：0.1N 塩酸

※3種の溶液は、品番24901-250には各250 mL ずつ（100スライド分）、品番24901-500には各500 mL ずつ（200スライド分）含まれています。

1. 脱パラフィン処理し、蒸留水に水和します。
   （オプション：ワイゲルトヘマトキシリンで8分間処理）
2. 蒸留水でリンスします。
3. 溶液Aで2分間処理します。
4. 蒸留水でリンスします。
5. 溶液Bで60分間処理します。
6. 溶液Cで2分間処理します。
7. 70％エタノールで45秒処理します。 脱水、透過、封入します。

明視野顕微鏡では、淡黄色のバックグランドの中赤く染色されたコラーゲンが確認できます。核を染色した場合は、黒（又は灰色又は茶色）に観察されます。長時間のピクロシリウスレッド処理により、核の脱色が起こることがありますが、通常のVan Gieson染色もしくpicro-aniline blueで1分間染色することでコラーゲン繊維を見分けることができます。

偏光顕微鏡の観察では、大きいコラーゲン線維は明るい黄色又はオレンジ色に、網状線維を含む細いコラーゲン線維は緑色に見えます。 Junqueiraら（1979）によると、複屈折はコラーゲンの型に特異的です。基底膜、ケラトヒアリン顆粒、粘液中のIV型コラーゲンを含むいくつかの素材は、赤く染色されますが、複屈折を起こしません。単一方向からの観察では複屈折が確認できない線維があるため、全ての線維を確認するためには、スライドを回転する必要があります。この不便さは、顕微鏡に通常の偏光ではなく円偏光を備え付けることで回避できます(Whittaker et al., 1994; Whittaker, 1995)が、その場合は完全な黒色背景は得られません。

このメソッドは非常に簡単ですが、操作者と異なる人がスライドを使用する場合、それがどのような働きをするかを知ることは非常に重要です。偏光顕微鏡を使用しなくても、Picrosirius Redは、細網線維、大脳毛細血管の基底層のようなもの（ワンギーソン染色では確認できず、その他の3色染色法(Mallory, Masson, Heidenhainなど）でも曖昧にしか見えない）を観察することができます。

偏光のみを使用する場合、ピクリン酸染色の「黄色のバックグランド」を見失うことは重要ではありません。もしワンギーソン染色の改良としてPicrosirius Red を使用し、黄色の細胞質を保つ必要がある場合、ワンギーソン法よりも脱水操作をすばやく実施してください。Picrosirius Red染色を行う際は、必ず以下の文献１および2をお読みください。

1. Junqueira LCU, Bignolas G, Brentani RR. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J 1979; 11, 447-455

2. Puchtler H, Waldrop FS, Valentine LS. Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA. Beitr Path 1973; 150, 174-187

3. Whittaker P. Polarized light microscopy in biomedical research. Microscopy and Analysis 1995; 44, 15-17

4. Whittaker P, Kloner RA, Boughner DR, Pickering JG. Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light. Basic Research in Cardiology 1994; 89, 397-410

5. Kiernan. J.A., ( 999) Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, Ed. 3 Butterworth Heinemann, Oxford, UK.

プロトコールは、セロイジン、凍結樹脂、パラフィン切片などで調節してください。

• 効果的な操作のため、コントロールと同程度に染色できるよう、適切にブロックを準備してください。
• 核染色に失敗した場合は、鉄ヘマトキシリン又はCelestine Blueを使用しているか確認してください。もしアルミニウムヘマトキシリンを使用していた場合は、鉄ヘマトキシリン又はCelestine Blueに切り替えてください。
• ピクリン酸の染色と区別するため、Picrosirius Red染色する前に核が強く染色されていることを確認してください。
• 想定外の構造が染色された場合は、固定剤の影響です。固定時に起きた変化のために染色も変化することがあります。
• 予想される結果よりも染色が黄色すぎる又は赤すぎる場合、固定剤を確認してください。血液凝固性の固定剤はより赤く、クロスリンクさせる固定剤はより黄色く染まります。
• 細胞質が赤く染色された場合、Picrosirius Red Stainが酸性条件下または高温により加水分解されているかもしれません。高温の設備ではこの現象に注意が必要です。
• 神経解剖学的研究などのために切片を厚く切った場合、予想より染色が黄色くなることがあります。染色時間を長くするか、染色槽を加熱してください。
• 過剰な染色の除去及び脱水の間に、切片が赤くなってしまったら、小分子ピクリン酸がリンス（リンスをしていた場合）又は脱水アルコール（アルコール中の水分濃度が高い場合）によって選択的に洗い流され、高分子で疎水性の赤い酸性色素が残ってしまった可能性があります。水の関わるステップをアルコールに替えてリンスするか、脱水時間を短くしてください。
• 親水性樹脂に包埋した切片は、コラーゲンが赤く染色されない可能性があります。樹脂が高分子の赤い色素の透過を阻害しているかもしれません。染色時間を長くし、可塑剤として少量のアルコールを染色槽に加えるか、加熱してください。 赤色酸性色素は日光により退色します。染色した切片を日光に曝さないでください。
• 親水性樹脂の包埋でしわが生じる場合は、樹脂中のクロスリンカーの量を高くすることができます。

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