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研究用

ABC染色に基づく免疫組織化学検出システムImmunoCruz™ ABC Staining System

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Santa Cruz Biotechnology社では、免疫組織化学適応用一次抗体の使用を容易にするABC染色システム「ImmunoCruz™ ABC Staining System」を提供しています。Avidin-Biotin-peroxidase Complex を利用して検出を行います。

ImmunoCruz ABC Staining System

構成内容

  • 1.0 mL正常ブロッキング血清
  • 250 µgビオチン化二次抗体
  • 0.5 mLアビジン
  • 0.5 mLビオチン化セイヨウワサビペルオキシダーゼ(AB試薬)
  • 1.0 mL 50x ペルオキシダーゼ基質
  • 1.0 mL 50x DAB色原体
  • 3.0 mL 10x 基質バッファー
  • 試薬調製用混和ボトル

*ABC染色システム1個で200枚のスライドを染色できます。
*ガラス蒸留水で調製したPBS、0.1〜1%過酸化水素(PBS、蒸留水、またはメタノールで希釈)、一次抗体、固定や脱パラフィン用の試薬、対比染色、封入剤等は別途ご用意ください。

ABC染色システムの試薬調製

  • ブロッキング血清:混和ボトル1(青色キャップ)で、75 µL正常ブロッキング血清ストックと5 mL PBSを混和します。
  • ビオチン化二次抗体:混和ボトル2(緑色キャップ)で、75 µL正常ブロッキング血清ストック、5 mL PBS、25 µLビオチン化二次抗体ストックを混和します。
  • AB酵素溶液:AB混和ボトル(紫色キャップ)で、50 µL試薬A(アビジン)、50 µL試薬B(ビオチン化HRP)、2.5 mL PBSを混和します。混和後、約30分間静置します。
  • ペルオキシダーゼ試薬:基質混和ボトル(黄色キャップ)で、1.6 mL蒸留水、5滴の10x 基質バッファー、1滴の50x DAB色原体、1滴の50xペルオキシダーゼ試薬を混和します。15-20枚のスライドに足りる量です。

注意事項:
新しく調製したバッファー以外は使用しないでください。試薬調製はすべて付属の混和ボトルで行います。調製後、液滴ディスペンサー栓(逆向きで供給)をキャップに正しい向きで挿入します。組み合わせた部品をボトルに乗せ、キャップを捻ると、液滴ディスペンサーがはまります。再充填の際に液滴ディスペンサーを外すには、親指で横向きに押し込みます。蒸発を防ぐために、使用中以外は確実にキャプを閉めてください。染色作業が終了したら、調製した試薬は破棄して混和ボトルは蒸留水で洗浄します。

免疫ペルオキシダーゼ染色の手順

  • オプション:組織切片の調製後、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、PBS、蒸留水、またはメタノールで希釈した0.1〜1%の過酸化水素溶液中で5〜10分間インキュベートします。PBSで5分間2回洗浄します。
  • オプション:切片を1.5%ブロッキング血清PBS溶液(混和ボトル1)中で1時間インキュベートします。この作業は非特異的な染色が問題とならない場合は省略可能です。スライド上の過剰なブロッキング血清は吸い取ってください。
  • 切片を一次抗体で、室温で30分または4℃で一晩インキュベートします。最適な抗体濃度は力価測定により決定してください。推奨範囲は、1.5%ブロッキング血清PBS溶液(混和ボトル1)で希釈した濃度で0.5〜5.0 µg/mLです。PBSで5分間3回洗浄します。
  • 切片を、混和ボトル2のように、または約1 µg/mLに調製したビオチン化二次抗体で30分間インキュベートします。PBSで5分間3回洗浄します。
  • 切片をAB酵素試薬(AB混和ボトル)で30分間インキュベートします。PBSで5分間3回洗浄します。
  • 切片を1〜3滴のペルオキシダーゼ基質(基質混和ボトル)で30秒〜10分間、または希望の染色強度が得られるまでインキュベートします。水洗して顕微鏡観察を行い、切片の染色を確認してください。必要に応じて、ペルオキシダーゼ基質を追加してインキュベートを継続します。蒸留水で5分間洗浄します。
  • オプション:ギル組成#2のヘマトキシリンで5〜10秒対比染色します。直ちに蒸留水で5分間洗浄します。
  • オプション:酸性アルコールと青味付け剤で脱染色します。水道水で洗浄します。
  • パラフィン包埋組織切片では、95%エタノール10秒間2回、100%エタノール10秒間2回、キシレン10秒間3回で脱水します。剰余キシレンを拭き取ります。
  • 直ちに1〜2滴の永久封入剤を滴下し、カバーガラスで覆います。顕微鏡で観察します。

注意事項:
作業はすべて加湿された室温で行ってください。必要に応じて染色皿、染色壺をご使用ください。切片を完全に覆うのに十分な量、通常100 µLまたは1〜3滴の試薬を滴下します。吸引器を用いて試薬を除去しますが、標本の乾燥は避けてください。

使用例

ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト乳癌組織の免疫ペルオキシダーゼ染色
図1. P53 (DO-1): sc-126
ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト乳癌組織の免疫ペルオキシダーゼ染色。導管上皮で強い核染色が確認できる。

ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト結腸癌組織の免疫ペルオキシダーゼ染色
図2. ICAM-1 (G-5): sc-8439
ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト結腸癌組織の免疫ペルオキシダーゼ染色において、ICAM-1の膜局在が確認できる。

ImmunoCruz™ mouse ABC Staining System(マウス)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

ImmunoCruzTM ABC Staining System, Mouse詳細データ

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品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

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ImmunoCruz(R) goat ABC Staining System, Goat詳細データ

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ImmunoCruz™ ABC and LSAB Staining Systems

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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