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記事ID : 33036
研究用

高分解能質量分析計とS-Trap法により圧倒的な同定数を実現!nano ESI LC-MS/MSシステムによるショットガンプロテオーム解析

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質量分析計を基幹としたプロテオーム解析によるバイオマーカーの探索・検証技術は、近年非常に注目されている最先端の技術です。特に質量分析計の進歩は目覚ましく、0.1 µgのタンパク質消化サンプルから3,000以上のタンパク質を同定することも可能となっています。本受託分析では Thermo社のQ Exactive と Ultimate3000 システムを基盤として、前段階のサンプル前処理から受託を承っており、極力ユーザー様のニーズに合わせてソリューションを提供することを目指しております。

使用装置

Thermo Fisher Scientific社のQ Exactiveの図

図1. Thermo Fisher Scientific社のQ Exactive

本プロテオーム解析においては、質量分析計に Thermo社の Q Exactive を使用しています。Q Exactive は高分解能・高速スキャンを誇る高性能質量分析計であり、生体サンプルからのプロテオーム解析には申し分ない性能を誇る機種です。またフロント部の nano LC システムには、リテンションタイムのずれがないように Thermo社の Ultimate3000 を独自にチューンし、オートサンプラーには CTC 社の PAL にデッドボリュームが少なく吸着を極力抑えたインジェクションバルブを使用しており、最小 1 µL の微量サンプルを正確にインジェクションし、0.1 mm 内径のカラムによって精密に成分を分離します。ナノ ESI ソースは密閉型 Dream Sprayソースを採用し、ノイズを抑えた超高感度解析を実現いたします。

 

オプション

●S-trap™によるサンプル前処理 ∼プロテオーム解析に使用するサンプルは実はタンパク質が十分に可溶化していないことはご存知でしたか?∼

BYS_STrap_1.jpg

図2. S-Trap™。タンパク質処理量に応じて3種類のラインナップから選択することが可能です。

 

バイオシス社ではS-trapを使用したサンプル中のSDS除去・酵素消化を導入・推奨しております。膜タンパク質をはじめ、可溶化の困難なタンパク質は多数存在しており、SDSによる可溶化が強力であることは言うまでもありません。しかしLC/MSによる解析の場合、サンプル中のSDSの存在は障壁となり除去しなくてはなりませんがSDSの除去には高度なテクニックが必要になります。S-Trap法は5%の高濃度SDSをLysate Bufferとして細胞中に存在する全てのタンパク質の可溶化を行い、S-Trapのスピンカラム中に配置されたタンパク質保持用の充填剤に加えて処理を行う方法です。保持されたタンパク質は充填剤上で消化酵素によってペプチドサイズに消化されます。消化効率も高く、トリプシン消化の場合、47℃、1時間で酵素消化が完了します。以下にS-Trap法と既存のゲルショットガン法、コール酸処理法によりHeLa cell lysateをサンプル処理しショットガンプロテオーム解析による比較を行ったデータを示しました。S-Trap法はゲルショットガン法、コール酸処理法と遜色ないデータを示し、一方、サンプル処理の簡便さから高い有用性を示すことが分かりました。

 

BYS_STrap_2.jpg

図3. S-Trap処理法と既存の方法との比較-LC/MS Base Peak Chromatogram-
上:S-Trap処理、中:ゲルショットガン処理、下:コール酸処理
サンプル:HeLa cell lysate、LC/MS:OrbiTrap Elite (Thermo)
●SDSは完全に除去されていることを確認致しました。

 

表1. S-Trap処理法と既存の方法との比較-タンパク質・ペプチド同定数-
  DOC GS S Trap
Protein ID 1647 1097 1730
Peptide ID 9571 3840 8506

サンプル:HeLa cell lysate、LC/MS:OrbiTrap Elite (Thermo)
DOC; コール酸処理, GS; ゲルショットガン処理, S-Trap; S-Trap処理
●タンパク質同定数において既存の2種類の方法と同等であることを確認致しました。

 

表2. S-Trap処理法と既存の方法との比較-細胞成分ごとのタンパク質同定数(%)-

 

DOC

GS

S-Trap

Golgi apparatus

7.9

6.4

7.9

cytoplasm

80.7

78.3

80.4

*cytoskeleton

16.2

18.4

15.9

endoplasmic reticulum

10.9

8.7

10.5

endosome

3.5

2.8

4.0

extracellular region

7.1

7.0

6.9

intracellular organelle

83.9

85.1

83.6

*membrane

36.9

33.7

36.5

mitochondrion

18.4

16.1

17.7

nucleus

48.1

52.2

48.7

*organelle membrane

18.2

14.8

17.7

organelle part

68.1

70.5

68.0

*plasma membrane

18.3

18.4

18.3

ribosome

5.8

7.3

5.6

サンプル:HeLa cell lysate、LC/MS:OrbiTrap Elite (Thermo)
DOC; コール酸処理, GS; ゲルショットガン処理, S-Trap; S-Trap処理
*は細胞成分の膜に局在化するタンパク質
●膜タンパク質においてもS-Trap法はほかの2種の処理方法とほぼ同等であることを確認しました。

 

●Tryp-Nによる酵素消化

通常用いられるトリプシン(リジン、アルギニンC端の切断)とは異なり、リジンとアルギニンのN端での切断を可能にした消化酵素です。トリプシン同様に部位特異性が高く、またプロリンの切断も可能ですので、カバレージの向上が期待できます。

■Type-Nの特徴

  • R/K特異的にN-末端で切断
  • 部位特異性はトリプシンと同等:∼ 95%
  • Proline = no care
  • Methylation = no care

No ion current dilution between termini
SRMにおいて強いbイオンシグナルを利用できる

■トリプシンとの比較

  • Median fold increase in sensitivity = 4.5×.
  • Average = 35.4×.
  • 50%Cl = 1.96×-18.6×x increase.
  • メタロプロテアーゼ
  • EDTAにより反応をON/OFF
  • Partial Digestionが可能
  • カバレージの向上
  • 高温(65℃)でも機能するのでサンプルを65℃で処理することにより、ほとんどの溶液中のタンパク質がDenatureして酵素消化が向上する。
  • Really stable (salt, almost all buffers ok, etc.)
  • Doesn't auto-digest

●スペクトラルカウント解析によるノンラベル定量解析

データ解析に関して、スペクトラルカウント解析によるノンラベル比較定量(下記論文1-4参照)をオプションで承っております。スペクトラルカウントは取得したLC/MS/MSのデータをそのまま使用して半定量解析を行う手法であり、改めて測定を行う必要がありません。スペクトラルカウントは群間比較による比較定量を行うので、論文化などオフィシャルに確度の高いデータを取得するためには最小単位として2群(1群あたり3サンプル)の合計6サンプルが必要となります。ただし目的に応じて、例としてサンプル1対1の比較の検討などの調整は可能ですのでお気軽にご相談下さい。

 スペクトラルカウント参考文献

  1. Old W. et al., Mol Cel Proteomics 2005, 4, 1287.
  2. Powell DW. et al., (2004) Mol Cell Biol 24:7249-7259
  3. Paoletti AC., et al., (2006) PNAS 103:18928-18933.
  4. Xiaoyun Fu et al., (2008) Journal of Proteome Research 7, 845-854

 

●ダブル酵素消化(※ASP-N、V8等との組み合わせ消化)

タンパク質の切断部位の異なる酵素を組み合わせることによって消化効率の増加ならびにMS感度アップを図ります。

 

●その他特殊処理(コール酸処理、プロピオン酸ブロックなど)

コール酸処理:膜タンパク質など疎水性の高い解析難易度の高いタンパク質を含め、細胞中に存在する全てのタンパク質をプロテオーム解析するために考案された手法の一つです。バイオシス社では同等の方法(同様ではありません)としてSTrap法を推奨しています。

 

●ネットワーク解析及びパスウェイ解析

KEGGなどの既存のデータベースを元にタンパク質間の反応作用スキームに当てはめて解析する方法です。

プロテオーム解析 試験内容

●サンプル前処理条件検討

バイオシス・テクノロジーズ社技術担当者がお客様ご要望のLC/MS解析を実施致します。ご要望に応じてご提供いただきましたサンプルの前処理から承っております。すでにお客様にてサンプル前処理を実施いただいている場合はそのままLC/MSにて解析をスタート致します。解析期間は分析サンプル数や測定対象内容に依存致します。

●LC/MS試験測定ならびに本測定

サンプル前処理が完了しますと、LC/MS測定条件最適化を実施します。すべての測定条件が整いましたら、対象サンプルの測定を実施します。まずはご用意いただいたサンプルの試験測定を行い最終的な測定条件の最適化を実施します。その後、実サンプルの本測定を行います。測定は(n=3)で実施致します。

●データ解析

LC/MSによって取得した生データはMASCOT™ Softwareによるデータ解析を行います。MASCOT™ SoftwareのデータをScaffold™ Softwareによるデータ精査を行います。さらにご要望に応じてノンラベル定量解析(スペクトラルカウント解析)によるデータ解析を行うことも可能です(有償)。ノンラベル定量解析(スペクトラルカウント解析)をご希望の場合はサンプル群間の比較解析を行いますので、最小単位として2群、サンプルは群ごとに3サンプル、合計6サンプルが必要になります。ただし目的に応じて、例としてサンプル1対1の比較を行いたいなどの調整は可能ですのでお気軽にご相談下さい。

●お送りいただくもの

測定試料はお客様にてご用意下さい。LC/MSの測定最適条件情報をすでにお持ちでご提示可能でしたらご提示をお願い致します。ご希望に応じて検体となる試料は当方にてトリプシン消化etc.による試料分解を行います(有償)。

●納品物

解析データならびにLC/MS測定条件を含めた解析条件情報

 

サンプル調整・輸送方法

必要サンプル量

総タンパク質10 µg 以上 (タンパク質サンプル溶液中) ショットガン解析においてはサンプル中に存在するタンパク質量が重要なポイントになります。高感度のLC/MSを解析に使用しますが、タンパク質量が多ければ多いほど同定の確率は高くなります。ショットガン解析にて網羅的にサンプル同定を目指す場合は10 µg以上は必要です。一方、ゲルブロックの場合、最小単位として銀染色でかろうじてバンドが確認できる量か限界です。CBB染色で確認できる量が目安となります。少ない量でのショットガン解析をご検討の場合は予めご相談ください。

サンプルの生物種につきまして

生物種をお知らせください。生物種が不明なサンプルはお受けできません。また感染性の可能性のあるサンプルにつきましてはお受けできません。生物種によってはお受けできない場合がございます。予めご了承ください。Human由来サンプルの場合はサンプルの状態により受託可能ですので、事前にご相談下さい。

サンプルの状態につきまして

タンパク質を溶解している溶媒の組成情報、サンプルの状態(溶液Stock、凍結乾燥etc.)を予めお知らせ下さい。溶媒組成によっては前処理方法の変更等を行う場合がございます。

サンプル調製につきまして

SDSなどの界面活性剤を使用しての調製を行う場合は予めお知らせください。弊社ではS-Trap法を推奨しております。詳細の調製方法につきましては、予めご相談ください。

サンプルの輸送につきまして

輸送温度はタンパク質溶液、細胞破砕液、組織破砕物、生体液、SDS-PAGEによるゲルブロックに関しましてはドライアイス梱包で冷凍便にて下記宛先まで平日着になるようにご送付下さい。また、SDS-PAGEによるゲルブロックはゲルブロックをそれぞれ1ブロックずつチューブに入れて下さい。なお、サンプルの紛失を避けるためにご送付前に配送業者名とお問合せ番号を jutaku_gr@cosmobio.co.jp までお知らせ下さい。その他輸送方法についてご不明な場合はご遠慮なくご相談下さい。

ご送付先:〒153-8904 東京都目黒区駒場4-6-1
東京大学先端科学技術研究センターKOL302
福田 哲也 宛

Tel: 080-8704-6706

●納品物

解析データならびにLC/MS測定条件を含めた解析条件情報

 

参考価格

項目 品名 希望販売価格/サンプル(税抜) 品番
コース LC/MS ショットガンプロテオーム解析
(1サンプルあたりn=3測定、MASCOT解析含む)
¥357,000
BT-SGPA-01
オプション
サンプル前処理
液中消化 I
(Whole Cell lysateなどタンパク質溶液)
¥143,000
(1〜5 サンプルまで)
BT-SGPA-02
液中消化 II
(免疫沈降サンプル)
¥143,000
(1〜5 サンプルまで)
BT-SGPA-03
ゲル内消化
¥143,000
(1〜10 ブロックまで)
BT-SGPA-04
S-trap処理
¥4,000
(タンパク質総量 300 µg 以下)
BT-SGPA-05
¥6,000
(タンパク質総量 300 µg〜10 mg)
Tryp-N処理
(消化酵素にTryp-Nを使用します)
¥9,000
BT-SGPA-06
ダブル酵素消化
(※ASP-N、V8等 との組み合わせ消化)
お問合せ
BT-SGPA-07
その他特殊処理
(コール酸処理、プロピオン酸ブロックなど)
お問合せ
BT-SGPA-08
オプション
データ解析
ノンラベル定量解析
(スペクトラルカウント解析)
¥100,000
BT-SGPA-09
ネットワーク解析
お問合せ
BT-SGPA-10
パスウェイ解析
お問合せ
BT-SGPA-11

お見積り・ご注文方法

下記のリンクから見積のご依頼をお願い致します。

参考文献

  1. Tetsuya Fukuda, Masaharu Nomura, Yasufumi Kato, Hiromasa Tojo, Kiyonaga Fujii, Toshitaka Nagao, Yasuhiko Bando, Thomas E. Fehniger, Gyorgy Marko-Varga, Haruhiko nakamura, Harufumi Kato, Toshihide Nishimura, A Selected-Reaction Monitoring Mass Spectrometric Assessment of Biomarker Candidates Diagnosing Large-cell Neuroendocrine Lung Carcinoma by The Scaling Method Using Endogenous References. Plos One, published: April 27 (2017)
  2. Nakayama N, Bando Y, Fukuda T, Kawamura T, Nakamura H, Marko-Varga G, Nishimura T. Perspective Article. Developments of Mass Spectrometry-Based Technologies for Effective Drug Development Linked with Clinical Proteomes. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, (2015) 1-9, In press.
  3. Tetsuya Fukuda, Hiroshi Hike, Fumihiko Usui, Yasuhiko Bando, Toshihide Nishimura, Tatsuhiko Kodama, Takeshi Kawamura, An improvement on mass spectrometry-based epigenetic analysis of large histone-derived peptides by using the Ionization Variable Unit interface, Analytical Biochemistry 486 (2015) 14-16
  4. Takadate Tatsuyuki, Onogawa Tohru, Fukuda, Tetsuya, Motoi Fuyuhiko, et al., Novel prognostic protein markers of resectable pancreatic cancer identified by coupled shotgun and targeted proteomics using formalin-fixed paraffinembedded tissues, International Journal of Cancer (2013)132, 1368-1382
  5. Tadashi Imanishi, Yoko Nagai, Takuya Habara, Chisato Yamasaki, Jun-ichi Takeda, Sayaka Mikami, Yasuhiko Bando, Hiromasa Tojo, and Toshihide Nishimura Perspectives: Full-length transcriptome-based H-InvDB throws a new light on chromosome-centric proteomics. 2013, Journal of Proteome Res. 12(1): 62-66.
  6. Toshihide Nishimura, Makoto Kihara, Junichi Kamiie, Hirotaka Kawakami, Yasuhiko Bando, Andrew J. Alpert, Tadayuki Ogawa, Hiromasa Tojo, Indigenome and Indigenomics: Targeted Quantitative Analysis of Native Biomolecules on Their Expression and Variety of Indigenous Forms -Represented by Proteins-. BUNSEKI KAGAKU Vol. 61, No. 6, pp. 445-457(2012)
  7. Tatsuyuki Takadate, Tohru Onogawa, Kiyonaga Fujii, Fuyuhiko Motoi, Sayaka Mikami, Tetsuya Fukuda, Makoto Kihara, et al., Nm23/nucleoside diphosphate kinase-A as a potent prognostic marker in invasive pancreatic ductal carcinoma identified by proteomic analysis of laser micro-dissected formalin-fixed paraffin-embedded tissue, Clinical Proteomics (2012) 9(1):8
  8. Toshihide Nishimura, Harubumi Kato, Norihiko Ikeda, Makoto Kihara, Masaharu Nomura, Yasufumi Kato and György Marko-Varga. Cancer Phenotype Diagnosis and Drug Efficacy within Japanese Health Care. 2012, International Journal of Proteomics (2012), Article ID 921901, 10 pages.
  9. Yoshiyuki Ban, Gou Yamamoto, Michiya Takada, Shigeo Hayashi, Yoshio Ban, Kazuo Shimizu, Haruki Akasu, Takehito Igarashi, Yasuhiko Bando, Tetsuhiko Tachikawa, Tsutomu Hirano, Proteomic Pro?lingof Thyroid Papillary Carcinoma. Journal of Thyroid Research Volume 2012, Article ID 815079, 7 pages
  10. Masaharu Nomura, Tetsuya Fukuda, Kiyonaga Fujii, et.al., Preferential expression of potential markers for cancer stem cells in large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. An FFPE proteomic study, Journal of Clinical Bioinformatics (2011) 1:23
  11. Harubumi Kato, Toshihide Nishimura, Takashi Hirano, Masaharu Nomura,Hiromasa Tojo, Kiyonaga Fujii, Takeshi Kawamura, Sayaka Mikami, Makoto Kihara, Yasuhiko Bando, Masahiro Tsuboi, Norihiko Ikeda, Gyorgy Marko-Varga., A Clinician View and Experience of Proteomic Studies in the Light of Lung Cancer in Japanese Healthcare 2011 Journal of Proteome Research, 10: 51-57.
  12. (12) Harubumi Kato, Toshihide Nishimura, Norihiko Ikeda, et al., Developments for a growing Japanese patient population: Facilitating new technologies for future health care. J Proteomics. 2011 May 16;74(6):759-64.
  13. Toshihide Nishimura, Masaharu Nomura, Hiromasa Tojo, Hiroko Hamasaki, Tetsuya Fukuda, et al., Proteomic analysis of laser-microdissected paraffin-embedded tissues: (2) MRM assay for stage-related proteins upon non-metastatic lung adenocarcinoma, J of Proteomics 73(2010)1100-1110
  14. Michiya Takada, Yoshiyuki Ban, Gou Yamamoto, Toshihiko Ueda, Yuta Saito, Eiichi Nishimura, Kunimi Fujisawa, Ryohei Koide, Masakazu Mizutani, Tadahiko Kozawa, Yuji Shiraishi, Yasuhiko Bando, Tetsuhiko Tachikawa, Tsutomu Hirano, Periostin, discovered by nano-flow liquid chromatography and mass spectrometry, is a novel marker of diabetic retinopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Aug 20;399(2):221-6.
  15. Takeshi Kawamura, Masaharu Nomura, Hiromasa Tojo, Kiyonaga Fujii, Hiroko Hamasaki, Sayaka Mikami, Yasuhiko Bando, Harubumi Kato, Toshihide Nishimura, Proteomic analysis of laser-microdissected paraffin-embedded tissues: (1) Stage-related protein candidates upon non-metastatic lung adenocarcinoma., 2010, Journal of Proteomics, 73(6): 1089-1099.

お問い合わせ先 : 製品情報部

ご質問・ご不明の点は製品情報部までお問い合せください。また、秘密保持契約のご希望につきましても、下記までご連絡をお願いいたします。

TEL
03-5632-9615
FAX
03-5632-9614
E-mail
jutaku_gr@cosmobio.co.jp

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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