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記事ID : 33038
研究用

安定同位体標識ペプチドを使用したSRM/MRMによるペプチド絶対定量解析nano ESI SRM-LC/MSシステムによる定量プロテオーム解析

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臨床プロテオーム解析の研究には、常にターゲットプロテインの探索とターゲットプロテインとなった候補タンパク質に焦点を当てた定量分析をすることが求められています。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプル(FFPE tissue sample)やCell-lysateサンプルなど、LC/MSのバックグラウンドイオンになり得るマトリクスを多く含む生体試料サンプルでは通常定量解析は困難で、ペプチドに対するラベル化などいくつかの工夫を行わなければなりませんでした。しかし、選択反応モニタリング(SRM)と多重反応モニタリング(MRM)を組み合わせた質量分析技術を使用することにより、ターゲットとなるタンパク質由来のペプチドを選択的に、しかも高感度、定量的に検出可能となりました。
SRM/MRMは、ESIによりイオン化したペプチドイオンをQ1で選択的に透過させ、他のイオンは排除して次のコリジョンセルであるQ2に送り込みます。そしてQ2で不活性ガスにイオンを衝突させてイオンの開裂を起こさせ、Q3でさらに開裂したイオンから対象イオン由来の特徴的プロダクトイオンのみを透過させて検出器で検出します。このようにQ1でプリカーサーイオンのみを選択し、Q3でプロダクトイオンのみを透過させることにより二段階でのイオン選択を行うため、ノイズイオンは極力排除され、結果、ダイナミックレンジの高い解析を可能にします。また、SRM/MRMの特徴として高速スキャンが可能であり(数十msec)、多数のターゲットタンパク質、ターゲットペプチドが対象であっても測定可能であることも大きな魅力となっています。さらにこのSRM対象の試料に安定同位体標識ペプチド『AQUATM peptide』をスパイクすることにより、amolレベルでのターゲットペプチドの絶対定量へのアプローチが可能になります。

当解析技術では、測定に使用するnano ESI LC/MSに独自の密閉型ESIを使用しており、測定ノイズの原因となる外気からのイオンをフィルターカットしてESIに送り込むため、安定かつより高感度の定量解析を実現しています。

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三連四重極型質量分析計システムThermo Scientific™ 『TSQ Quantiva™』ならびに密閉型nano ESI

ペプチド絶対定量解析試験内容

●SRM LC/MS測定条件検討

バイオシス・テクノロジーズ社解析担当者がお客様ご要望のターゲットタンパク質のSRM LC/MS解析を実施致します。
解析検討はターゲットタンパク質のSRM LC/MS測定条件の検討から始まります。測定条件の最適化を行いプロトコールの作成を進めます。SRM(MRM)測定条件(SRM transitions)がご提示可能である場合と、新規に検討する場合では検証時間と費用が異なります。解析期間は分析サンプル数や測定対象内容に依存致します。

●AQUA™ peptide合成ならびにLC/MS測定条件最適化

ターゲットペプチドのSRM/MRM測定条件最適化が完了しますと、安定同位体標識ペプチド『AQUA™ peptide』の合成ならびにLC/MS測定条件最適化を実施します。対象検体の候補がすでに決定している場合は、構造物のLC/MSによる測定条件の最適化を行います。

●SRM/MRM試験測定ならびに本測定

すべての測定条件が整いましたら、対象サンプルの測定を実施します。まずはご用意いただいたサンプルの試験測定を行い最終的な測定条件の最適化を実施します。その後、実サンプルの本測定を行います。測定は(n=3)で実施致します。

●お送りいただくもの

ターゲットタンパク質または測定試料はお客様にてご用意下さい。SRM/MRMの測定最適条件(SRM transitions)がございましたらご提示をお願い致します。検体となる試料は当方にてトリプシン消化による試料分解を行います。

ご送付先:〒153-8904 東京都目黒区駒場4-6-1
東京大学先端科学技術研究センターKOL302
福田 哲也 宛

Tel: 080-8704-6706

●納品物

解析データならびにSRM(MRM)測定条件を含めた解析条件情報
 解析結果報告書例

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お見積り・ご注文方法

下記のリンクから見積のご依頼をお願い致します。

参考文献


SRM/MRMによる定量プロテオミクス解析(ターゲットプロテオミクス解析)


  1. Tetsuya Fukuda, Masaharu Nomura, Yasufumi Kato, Hiromasa Tojo, Kiyonaga Fujii, Toshitaka Nagao, Yasuhiko Bando, Thomas E. Fehniger, Gyorgy Marko-Varga, Haruhiko nakamura, Harufumi Kato, Toshihide Nishimura, A Selected-Reaction Monitoring Mass Spectrometric Assessment of Biomarker Candidates Diagnosing Large-cell Neuroendocrine Lung Carcinoma by The Scaling Method Using Endogenous References. Plos One, published: April 27 (2017)
  2. Nakayama N, Bando Y, Fukuda T, Kawamura T, Nakamura H, Marko-Varga G, Nishimura T. Perspective Article. Developments of Mass Spectrometry?Based Technologies for Effective Drug Development Linked with Clinical Proteomes. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, (2015) 1-9, In press. ※[2]
  3. Takadate Tatsuyuki, Onogawa Tohru, Fukuda, Tetsuya, Motoi Fuyuhiko, et al., Novel prognostic protein markers of resectable pancreatic cancer identified by coupled shotgun and targeted proteomics using formalin-fixed paraffinembedded tissues, International Journal of Cancer (2013)132, 1368?1382 ※[2]
  4. Toshihide Nishimura, Makoto Kihara, Junichi Kamiie, Hirotaka Kawakami, Yasuhiko Bando, Andrew J. Alpert, Tadayuki Ogawa, Hiromasa Tojo, Indigenome and Indigenomics: Targeted Quantitative Analysis of Native Biomolecules on Their Expression and Variety of Indigenous Forms -Represented by Proteins-. BUNSEKI KAGAKU Vol. 61, No. 6, pp. 445-457(2012)
  5. Tatsuyuki Takadate, Tohru Onogawa, Kiyonaga Fujii, Fuyuhiko Motoi, Sayaka Mikami, Tetsuya Fukuda, Makoto Kihara, et al., Nm23/nucleoside diphosphate kinase-A as a potent prognostic marker in invasive pancreatic ductal carcinoma identified by proteomic analysis of laser micro-dissected formalin-fixed paraffin-embedded tissue, Clinical Proteomics (2012) 9(1):8
  6. Masaharu Nomura, Tetsuya Fukuda, Kiyonaga Fujii, et.al., Preferential expression of potential markers for cancer stem cells in large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. An FFPE proteomic study, Journal of Clinical Bioinformatics (2011) 1:23
  7. Toshihide Nishimura, Masaharu Nomura, Hiromasa Tojo, Hiroko Hamasaki, Tetsuya Fukuda, et al., Proteomic analysis of laser-microdissected paraffin-embedded tissues: (2) MRM assay for stage-related proteins upon non-metastatic lung adenocarcinoma, J of Proteomics 73(2010)1100?1110

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