翻訳後修飾の解析に Signal-Seeker™ SUMO化タンパク質検出キット

Signal-Seeker™ SUMO化タンパク質検出キットは、アフィニティービーズを用いて、細胞／組織ライセートからSUMO化されたタンパク質を免疫沈降により濃縮できるキットです。

SUMO化タンパク質を濃縮した後、目的のタンパク質を認識する一次抗体を用いて、ウェスタンブロットにより検出・解析します（ウェスタンブロットに使用する抗体はキットに含まれません）。

技術情報

• Cytoskeleton（CYT）社 signal seeker 翻訳後修飾（PTM）検出キットによる標的タンパク質のメカニズム解明

• 一過性の調節メカニズムの研究
• シグナル伝達経路に関わる複数のタンパク質の測定
• 目的タンパク質の新しい修飾の発見
• 調節メカニズムの解析
• シグナル伝達に関わる、内在性 または 一過性に発現するタンパク質の測定

キットには30反応分の試薬が含まれています。

その他 必要な試薬・機器

• 目的の培養細胞／組織
• PBS, pH 7.4（10 mM phosphate buffer pH 7.4, 140 mM NaCl, 3 mM KCl）
• セルスクレーパー
• 液体窒素（細胞ライセートの凍結用）
• SDS-PAGE 用電気泳動装置・バッファー
• ウェスタンブロット用転写装置・バッファー
• 目的のタンパク質を認識する一次抗体
• HRP標識 二次抗体
• 2-メルカプトエタノール
• 化学発光測定装置

図1. アッセイフロー

図2. Signal Seeker™ SUMOylation 2/3 Detection Kit を使用した免疫沈降
以前に報告された方法に従い、HeLa細胞（"HS43"：42℃で10分間ヒートショック処理、"CT37"：未処理）および HeLa siRNA SUMO ノックダウン（"KDS2"）から、変性条件で細胞ライセートを調製した¹。SUMO-2/3 コンジュゲートの免疫沈降には、1mg のライセートを用いた。免疫沈降（IP）は、プロトコールに従い行った。免疫沈降したタンパク質のウェスタンブロットには、(A) 抗 SUMO-2/3 抗体（品番： ASM23）、(B) 抗 Ubc9 抗体を使用した。ヒートショック処理した細胞の SUMO-2/3 コンジュゲートの量はコントロールと比較して増加しており、shRNA SUMO-2 ノックダウンでは低下していた。
(B) 未結合の Ubc9 は 18kDa 付近に観察される。高分子量のバンドは、Ubc9 に1分子の SUMO-2/3 タンパク質が結合していることを示す。Ubc9 は、SUMO化の標的であることが報告されている^1,2。

図3. Signal-Seeker™ SUMOylation 1 Detection Kitを用いたトータルSUMO1プロファイルの免疫沈降 (旧 SUMO1ツールとの比較)

A: BlastR 溶解およびフィルターシステムを使用して、HAP1 野生型 (WT) または SUMO1 ノックアウト (KO) ライセートを調整した。1 mg の各ライセートを 40 µg の各 SUMO1 アフィニティー試薬とともにインキュベートした。[ASM11 ビーズ (Cytoskeleton社)、21C7 (Invitrogen社-精製)、21C7 (DSHB社-上清)、D11 ビーズ (Santa Cruz社)、SUMO1 IgG 結合コントロール ビーズ (品番：CIG03)] 21C7 抗体をプロテイン G アガロース ビーズで捕捉し、SUMO-1 修飾タンパク質を濃縮した。サンプルを SDS-PAGE で分離し、PVDF に転写した。濃縮した SUMO1 サンプルを、SUMO-1抗体（Cytoskeleton社、品番：ASM01 、1:5000 in 5% milk ）とマウス Trueblot Ultra-HRP 二次抗体（1:1000 in 5% milk）を用いたウェスタンブロットによって分析した。Trueblot 二次抗体を使用して、21C7 サンプルからの重鎖および軽鎖の検出を最小限に抑えた。

B: 図Aと同様に、ASM11 を使用して IP を実行した。SUMO1修飾タンパク質をSUMO-1抗体（Cytoskeleton社、品番：ASM01 、1:5000）と抗マウス二次抗体（1:20,000）で視覚化した。IPに非結合抗体を使用し、重鎖および軽鎖の干渉によりマスクされる可能性のある64-30 kDa領域のSUMO化タンパク質のプロファイルを強調した。

図4. Signal-Seeker™ SUMOylation 1 Detection Kitを用いたSUMO1修飾標的タンパク質の免疫沈降(旧 SUMO1ツールとの比較)

HAP1 野生型 (WT) または SUMO1 ノックアウト (KO) ライセートは、BlastR 溶解およびフィルターシステムを使用して調整した。1 mg の各ライセートを 40 µg の各 SUMO1 アフィニティー試薬とインキュベーションした。ASM11 ビーズ (Cytoskeleton社)、21C7 (DSHB 社 - 上清)、およびSUMO1 IgG 結合コントロール ビーズ (CIG03) とインキュベートしました。21C7 抗体をプロテイン G アガロース ビーズで捕捉し、SUMO-1 修飾タンパク質を濃縮した。サンプルを SDS-PAGE で分離し、PVDF に転写した。標的タンパク質（図A: TFII-I、RanGAP1、図B: Schmd1） の SUMO1 修飾をウェスタンブロットによって分析した。HRP 標識抗ウサギ二次抗体を1:10,000で使用した。なお、3つの一次抗体はすべてウサギポリクローナル抗体であり、IP 抗体由来の重鎖および軽鎖フラグメントに結合しないはずである。

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