記事ID ： 16356

翻訳後修飾の解析に Signal-Seeker™ ユビキチン化タンパク質検出キット

メーカー名：Cytoskeleton, Inc.

Signal-Seeker™ ユビキチン化タンパク質検出キットは、アフィニティービーズを用いて、細胞／組織ライセートからユビキチン化されたタンパク質を免疫沈降により濃縮できるキットです。

ユビキチン化タンパク質を濃縮した後、目的のタンパク質を認識する一次抗体を用いて、ウェスタンブロットにより検出・解析します（ウェスタンブロットに使用する抗体はキットに含まれません）。

技術情報

Cytoskeleton（CYT）社 signal seeker 翻訳後修飾（PTM）検出キットによる標的タンパク質のメカニズム解明

使用目的

一過性の調節メカニズムの研究
シグナル伝達経路に関わる複数のタンパク質の測定
目的タンパク質の新しい修飾の発見
調節メカニズムの解析
シグナル伝達に関わる、内在性または一過性に発現するタンパク質の測定

構成内容

Signal-Seeker™ ユビキチン化タンパク質検出キット

キットには30反応分の試薬が含まれています。

BLASTR™　溶解バッファー
BLASTR™　希釈バッファー
BLASTR-2™　洗浄バッファー
脱ユビキチン化阻害剤（N-ethylmaleimide）
プロテアーゼ阻害剤カクテル
ユビキチンアフィニティービーズ1
ユビキチンIPコントロールビーズ（標的タンパク質の非特異的結合の評価）
HRP標識抗ユビキチン抗体
Precision Red™ Advanced Protein Assay 試薬
ビーズ溶出バッファー
DMSO
化学発光検出試薬A
化学発光検出試薬B
スピンカラム
スピンカラムコレクションチューブ
BLASTR™ フィルター

その他必要な試薬・機器

目的の培養細胞／組織
PBS, pH 7.4（10 mM phosphate buffer pH 7.4, 140 mM NaCl, 3 mM KCl）
セルスクレーパー
液体窒素（細胞ライセートの凍結用）
SDS-PAGE 用電気泳動装置・バッファー
ウェスタンブロット用転写装置・バッファー
目的のタンパク質を認識する一次抗体
HRP標識二次抗体
2-メルカプトエタノール
化学発光測定装置

アッセイ原理

（画像はクリックで拡大されます）

図1 アッセイフロー

使用例

ユビキチン化 Rac1 の検出

図2 ユビキチン化 Rac1 の検出
Swiss 3T3 細胞を、細菌毒素 CNF1で3時間処理（レーン4）［または未処理（レーン3）］し、BLAST™ バッファーで溶解した。マニュアルに従い、ライセート（アッセイあたり 300 µg）を調製した。抗 Rac1 抗体を用いて、ウェスタンブロットを行った。その結果、CNF1処理した細胞のライセートには、モノユビキチン化およびポリユビキチン化された Rac1 が検出され、これまでの報告と一致した[5]。
レーン1： 3% input
レーン2：コントロールビーズ + ライセート
全てのライセートに、プロテアーゼ阻害剤 MG132 が含まれる（10 µM/3h）。

ユビキチン化 p53 および総ユビキチン化タンパク質の検出

図3 ユビキチン化 p53 および総ユビキチン化タンパク質の検出
HeLa 細胞を 70% コンフルエントに増殖させ、BLAST™ バッファーで溶解して回収した。マニュアルに従い、ライセート（アッセイあたり 500 µg）を調製した。抗 p53 抗体を用いてウェスタンブロットを行い（A）、その後 HRP 標識抗ユビキチン抗体を用いてリプローブした（B）。
レーンA1： 2% input
レーンA2： HeLa 細胞ライセート 500 µL を、ユビキチンアフィニティービーズを用いた免疫沈降により濃縮
免疫沈降を行ったライセートでは、ユビキチン化された p53 が検出され、これまでの報告と一致した[6]。
Bは、HRP標識抗ユビキチン抗体でリプローブした結果を示す。レーンB1は、p53 の位置にわずかにシグナルが見られるが、リプローブの前に完全に除去されていなかったと考えられる。

参考文献

Wang, Y, et al. 2015. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol. Biol. Cell. 27: 410-420.
Guo, Z, et al. 2012. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell cycle progression. Mol. Cell. 47: 444-456.
Luo H-B, et al. 2014. SUMOylation at K340 inhibits Tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 16586-16591.
Satija Y.K. & Das S. 2016. Tyr99 phosphorylation determines the regulatory milieu of tumor suppressor p73. Oncogene 35: 513-5
Torrino S. et al. 2011. The E3 ubiquitin-ligase HACE1 catalyses the ubiquitination of active RAc1. Developmental Cell 21: 959-965.
Jin L. et al. 2013. Epigallocatechin gallate promotes p53 accumulation and activity via the inhibition of MDM2-mediated p53 ubiquitination in human lung cancer cells. Onc. Rep. 29: 1983-1990.
Nethe P. & Hordijk P. 2010. The role of ubiquitylation and degradation in RhoGTPase signaling. J. Cell Sci. 123: 4011-4018.
Ding F. et al. 2011. Ubiquitination in Rho signaling. Curr. Topics Med. Chem. 11: 2879-2887.
Visvikis O. et al. 2010. Direct modifications of Rho proteins: deconstructing GTPase regulation. Biol. Cell 102: 377-389.