メチル化ヒストンのChIPアッセイ用に開発されたspike-in SNAP-ChIP K-MetStat Panel

SNAP-ChIP（Sample Normalization & Antibody Profiling for ChIP）のK-MetStat™パネルは、H3およびH4ヒストンのメチル化リジンに対するChIPアッセイのspike-inとして、抗メチル化リジン抗体の特異性の検証やエフェクタータンパク質の結合試験に適しています。

SNAP-ChIPは、qPCRや次世代シーケンサーにより解読できる147bpのバーコードDNAに包まれた、E.coli由来の組み換えヒトヌクレオソーム（dNuc）を使用しており、クロマチン免疫沈降（ChIP）用に次世代のspike-inとして開発されました。

SNAP-ChIPのK-MetStat™（lysine-methylation status）パネルは、疾患に関連するH3およびH4ヒストンのリジン残基がメチル化された、16種類のdNucにより構成されています（右図参照、未修飾1（me0）＋メチル化修飾15：修飾サイト5種（H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H4K20）とメチル化の状態3種（me1, me2, me3））。

EpiCypher社のK-MetStat™ パネルは、従来のプロトコールを変更することなく様々なChIPアッセイに容易に加えることができる上に、抗体特異性の厳密なバリデーション（製品データ参照）や手技的なバラツキのモニタリングを可能とします。

• IP抗体の特異性およびプルダウン効率の特定
• サンプル間/実験間における手技的なバラツキをモニタリングし標準化
• DNAバーコードを定量PCRで測定することにより次世代シーケンスを行うべきか判断可能
• ホモジニアスに調製されたdNucによるlot-to-lotの厳密なコントロール

図1. SNAP-ChIPの概要
バーコードDNAによる識別可能な翻訳後修飾（PTM : post-translational modifications）をともなうdNucを、特異的抗体によるIP前にサンプルクロマチンに加えます。IP後、dNucのオンターゲット・オフターゲットの回収率をバーコードDNAで測定します。

詳細なプロトコールは、以下のマニュアルをご参照ください。

• SNAP-ChIP K-MetStat Panel Manual

SNAP-ChIP K-MetStatパネルには、ChIP実験10回分の試薬が含まれています。

• 組み換えモノヌクレオソーム16種類ミックス
  （10 mM カコジル酸ナトリウム、pH 7.5, 100 mM NaCl、1 mM EDTA、50%グリセロール (w/v)、1× プロテアーゼ阻害剤カクテル、100 µg/mL BSA、10 mM β-メルカプトエタノール）
  Molarity = 0.6 nM. MW = ~199382.1 Da (average MW of all 16 nucleosomes).

その他必要な試薬・機器

• ChIP用試薬
• TaqMan® or SYBR® green用試薬
  *感度の良いTaqMan® qPCRを推奨しますが、SYBR® green qPCRでも可能です。
• SNAP-ChIPプライマー（Forward/Reverse）
• qPCRプレート
• qPCR機

図2. SNAP-ChIPによる抗体特異性の評価
SNAP-ChIP試験（n=3）により、2種類の市販の抗H3K4me3抗体（#1および#2）の特性を評価した。抗体#1のH3K4のメチル化状態の変化に対する交差性は3%以下であったが、抗体#2はH3K4me2に対して60%程度の交差性を示しており、抗体#2を用いたChIPでは非特異性による実験結果への影響が示唆された。

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