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記事ID : 15642
研究用

免疫沈降(IP)によるSUMO化タンパク質の濃縮に最適SUMO-2/3 アフィニティービーズ

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SUMO-2/3 アフィニティービーズは、SUMO-2/3 抗体(クローン 11G2)にプロテインGビーズを化学的に結合させた製品で、免疫沈降(IP)アッセイに最適です。

本製品は、HeLa 細胞ライセート中の幅広い SUMO-2/3 標的タンパク質を免疫沈降させることが示されています。また、IPアッセイの際に、重鎖や軽鎖がビーズから解離して検出されないように最適化されており、非常にきれいなデータが得られます。

背景

SUMO: Small Ubiquitin-related Modifier

低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO: Small Ubiquitin-related Modifier)は、酵母から哺乳類細胞に至るまで高度に保存された 12 kDa の翻訳後修飾(PTM)タンパク質です1。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)には、1種類のSUMOタンパク質(Smt3)のみが存在し、脊椎動物では、3種類の主要な SUMO アイソフォーム(SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3)が、全ての組織に発現しています2。また、SUMO-1 は SMT3C、セントリン、GMP1、UBL1、PIC1としても知られています。成熟型 SUMO-2 と SUMO-3 は、アミノ酸配列が 97% 同一で(SUMO-1とは 48% 同一)、同一の機能をもつと考えられます。SUMO-1 と SUMO-2/3 は細胞内局在が異なり、また、SUMO-2/3 は一般的に SUMO-1 より高い発現レベルを示します3-5。タンパク質は、標的タンパク質のコンセンサス配列である ψKXE(ψ: 疎水性アミノ酸、X: 任意のアミノ酸)内のリジン残基がSUMO化されることによって、翻訳後修飾されます。SUMO-1は標的タンパク質に1分子のみ結合しますが、SUMO-2/3 タンパク質はポリSUMO-2/3 鎖を形成し、 SUMO-1 のライゲーションによって重合が終了します6,7。SUMO化は、非常に動的で可逆的なPTMで、遺伝子発現の調節、タンパク質の安定化、タンパク質輸送、有糸分裂、タンパク質間相互作用などの多様な細胞プロセスに関与することが示されています8,9

アプリケーション

免疫沈降(IP)

予備実験を行い、最適な使用濃度を決定してください。
本製品の品質は、本製品 40uL(50% ビーズ懸濁液)を用いて、細胞ライセート 1mg から、SUMO 2/3 の標的タンパク質とフリーの SUMO 2/3 を免疫沈降することで検証されています。

使用例

SUMO-2/3 抗体を用いた免疫沈降
(画像はクリックで拡大されます)

図1 SUMO-2/3 抗体を用いた免疫沈降
以前に報告された方法10 に従い、HS43、CT37、KD S2(HS43: ヒートショック処理(43℃、10分間)、 CT37: 未処理、KD S2: shRNA SUMO-2 ノックダウン)から、細胞ライセートを調製した。細胞ライセート 1mg を使用して、SUMO-2/3 コンジュゲートの免疫沈降を行った。免疫沈降したタンパク質のウェスタンブロットには、抗 SUMO-2/3 抗体(品番: ASM23)(A)/抗 Ubc9 抗体(B)を使用した。ヒートショック処理した細胞中の SUMO-2/3 コンジュゲート量はコントロールより増加しており、shRNA SUMO-2 でノックダウンした細胞ではコンジュゲート量が減少していた。SUMO-2/3 抗体(クローン 11G2)とビーズは化学的に結合されており、重鎖および軽鎖は検出されない。星印(*)と丸印(○)は、抗体の重鎖および軽鎖の位置を示す。結合していないフリーのSUMOは、三角形で示す。(B)結合していない Ubc9 は、120kDa の近くに観察される。高分子量のバンドは、1分子の SUMO-2/3 タンパク質が Ubc9 に結合していることを示す。Ubc9 は、SUMO化のターゲットであることが報告されている10,11

参考文献

  1. Chen A. et al. 1998. Characterization of mouse ubiquitin-like SMT3A and SMT3B cDNAs and gene/ pseudogenes. Biochem. Mol. Biol. Int. 46, 1161-1174
  2. Huang W.C. et al. 2004. Crystal structures of the human SUMO-2 protein at 1.6 A and 1.2 A resolution: implication on the functional differences of SUMO proteins. Eur. J. Biochem. 271, 4114- 4122.
  3. Saitoh H. & Hinchey J. 2000. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J. Biol. Chem. 275, 6252-6258.
  4. Manza L.L. et al. 2004. Global shifts in protein sumoylation in response to electrophile and oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 17, 1706-1715.
  5. Ayaydin F. & Dasso M. 2004. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol. Biol. Cell. 15, 5208-5218.
  6. Bohren K.M. et al. 2004. A M55V polymorphism in a novel SUMO gene (SUMO-4) differentially activates heat shock transcription factors and is associated with susceptibility to type I diabetes mellitus. J. Biol. Chem. 279, 27233-27238.
  7. Tatham M.H. et al. 2001. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J. Biol. Chem. 276, 35368-35374.
  8. Willson V. et al. 2009. SUMO Regulation of Cellular Processes. Springer.
  9. Wan J. et al. 2012. SUMOylation in control of accurate chromosome segregation during mitosis. Curr. Prot. Peptide Sci. 13, 467-481.
  10. Barysch S. et al. 2014. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9(4):896-909
  11. Becker J. et al. 2013. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Struc. & Mol. Biol. 20, 525-531.

SUMO-2/3 アフィニティービーズ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Anti SUMO-2/3 Affinity Beads,  (Mouse) , 11G2詳細データ

CYT

ASM24-BEADS

800 UL
[2 x 400 μl]
¥99,000

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