記事ID ： 13451

iPS細胞・ES細胞の分化マーカーを確認（マルチプレックスPCR法） Tri-Lineage Multiplex PCR iPSC Characterization Kit

メーカー名：Applied Biological Materials Inc.

Tri-Lineage マルチプレックス PCR キットは、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）、ヒト胚性幹細胞（hESCs）および胚性がん幹細胞（hECs）の多能性と分化状態をマルチプレックスPCR法で同時に判定するキットです。マルチプレックスPCR法は、免疫細胞化学を用いた方法に比べて、厳密なサンプル容量を必要としない迅速で効率的な手法です。

背景

iPS細胞（人工多能性幹細胞／iPSCs）は、体細胞由来の多能性幹細胞で、成体細胞を多能性状態にリプログラミングする遺伝子修飾と特定のDNA転写因子のインテグレーションによって誘導されます。iPS細胞は、特定の幹細胞遺伝子やタンパク質発現、クロマチンメチル化パターン、胚様体形成、倍化時間、テラトーマ形成、生存可能なキメラ形成、分化能力などの点で胚性幹細胞（ESCs）等の天然多能性幹細胞と同等の性質を有することが多くの文献において報告されています。天然の多能性幹細胞との関連性の多くは検証中ですが、多能性幹細胞の誘導には、Sox2、c-myc、 Lin28、 KLF4、そのほか特にOct4 およびNanog が重要な役割を果たしていることが示されています。

使用方法（概要）

トータルRNAサンプルを逆転写して得られるcDNAを使用し、マルチプレックスPCR反応によって、プライマー5セットを同時に増幅します。アガロースゲル電気泳動で、各プライマーのPCR産物の有無から細胞の多能性と分化状態を判定します。

• 使用するプライマーセット5種類
プライマー	フラグメントサイズ	詳細
Pou5f1/Oct4	~500bp	アクティブな多能性状態を示します。
AFP	~400bp	内胚葉系列への分化を示します。
ACTC1	~300bp	中胚葉系列への分化を示します。
SOX1	~200bp	外胚葉系列への分化を示します。
GAPDH	~1kb	RNA濃度の内部標準です。

使用プロトコール

1．マルチプレックスPCR反応液の調整
構成要素	Test sample	NTC Control
2X PCR Taq マスターミックス	25μl	25μl
Tri-Lineage プライマーミックス	1μl	1μl
cDNA from sample	1μl	‐
ddH₂O	23μl	24μl
トータルボリューム/1反応	50μl	50μl

2．PCR反応条件
ステップ	温度	時間	サイクル数
酵素活性化	95°C	5分	Hold
熱変性	95°C	30秒	30-40
アニーリング	60°C	30秒
伸長	72°C	60秒
最終伸長	72°C	10分	1
ホールド	4°C	‐	Hold

3．アガロースゲル電気泳動

アガロース電気泳動後、エチジウムブロマイドまたはSafeView™ を用いて染色してください。
PCR Taq Mastermix にはローディング色素があらかじめ混合されているため、別途ローディング色素を添加する必要はありません。DNAサイズマーカーには、1kb Plus OptiDNA Marker（品番：G248）を推奨しています。