サポート情報

Q&A

記事ID : 17876

FAQ : AAT Bioquest (ABD) 社 Amplite™ Fluorimetric NAD/NADH Ratio Assay Kit *Red Fluorescence*について

商品詳細:「Amplit™ Fluorimetric NAD/NADH Ratio Assay Kit(品番:15263)

【01】 このアッセイは NAD と NAD を別々に測定できますか?

はい。このキットでは構成品として提供する抽出溶液でサンプルを処理する事で NAD、NADH を別々に測定できます。このステップについては、プロトコールのステップ 3.4 をご参照ください。

pagetop

【02】 トータルNAD/NADH 値より、別々に測定して合計した値の方がはるかに大きくなってしまいます。どうして合わないのでしょうか。

多くの場合は、NADH を正しく読めていないからです。NAD 濃度によっては、NADH 抽出溶液がサンプル中のNADを除去できない場合があります。つまりNADが残ったまま測定しまっていることになります。検出プローブは高感度なため、少量でも NAD が残っていれば蛍光測定に影響を与えてしまいます。そのため、トータルNAD/NADHとNAD 抽出物を測定することをお奨めしています。NADH の値は、トータルNAD/NADAH 値から NAD 値を差し引くことで計算できます。これにより正しい濃度測定、NAD/NADH 率を測定することができます。

pagetop

【03】 このキットは pH に感受性がありますか?サンプルは pH が分かっているバッファーで調整するべきでしょうか?pH は蛍光測定に影響を与えますか?

pH は NAD あるいは NADH 抽出ステップのどちらにも影響を与える要因になります。NADH 抽出ステップ (対応するバッファーはコンポーネントD) は塩基性 (pH>7) で、NAD抽出ステップ (対応するバッファーはコンポーネントE) は酸性 (pH<7) です。さらに、使用しているNADHセンサーは pH 感受性になります。そのため中性条件下 (pH=7) で調製・測定を行ってください。

pagetop

【04】 典型的な NAD 対 NADH 比は?

哺乳類細胞ではトータルNAD/NADH 比は 10:1 として引用されています。

pagetop

【05】 サンプル量が非常に少ないのですが、アッセイに必要な最低細胞数を教えてください。また1ウェルあたりの最大細胞数はありますか?

測定に当たって、最低・最大細胞数の厳しい制限はありませんが、一般的なガイドラインは、少なくとも105〜106細胞/ mLです。細胞の濃度がより高いサンプルでは、より多くの抽出溶液が必要となることがあります。最終的には、最適な細胞密度はアプリケーションに強く依存します。

pagetop

【06】 使えるサンプルの種類を教えてください。

本キットは、植物、細菌、哺乳類の細胞で使用できます。調整方法は下記を参照ください。

植物細胞:
溶解バッファー (200 mg/mL) で葉をホモジナイズ後、遠心 (2500 rpm で 5-10分) してください。テストには上清をご使用ください。

微生物細胞サンプル:
微生物細胞を遠心 (10,000 g、 0℃、15分) で集め、溶解バッファーで100〜106 細胞/ mL に調整し、室温で15分置きます。直接細胞溶解物を使用するか、遠心 (1500 rpm、5分) 後の上清をテストにご使用ください。

pagetop

【07】 このキットは NADP/NADPH も測定できますか?

いいえ、できません。 NADP/NADPH 率を測定する場合は、Amplite™ Fluorimetric NADP/NADPH Ratio Assay Kit *Red Fluorescence* をご使用ください。

pagetop

【08】 サンプルの溶解調整方法を教えてください。

本キットには溶解バッファー (コンポーネントC) が添付されていますのでプロトコール (Appendix参照) に従い調整してください。

pagetop