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Q&A

記事ID : 11131

FAQ : Bioneer(BIN)社 siRNA製品について

A. 合成およびご注文について

B. 修飾siRNA

C. お取り扱い方法および保管方法

D. 精製

E. 定量化と濃度

F. 実験

A. 合成およびご注文について

【01】 siRNAの合成方法

最も一般的なsiRNA合成方法はKosterにより開発された「亜りん酸トリエステル法」です。本手法ではβ- シアノエチルフォスフォアミダイトを用いてRNA分子のホスホジエステル骨格を構築します(Nucl. Acids Res. 1984, 12, 4539 ; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843) 。核酸合成は、最初の核酸塩基が結合している支持体(CPG)を用いて行います。非ブロック化、カップリング(共役)、キャップ形成、酸化といったサイクルを目的siRNA分子が形成されるまで繰返します。合成終了後、アンモニアを使って支持体より核酸を切り離します。その後、siRNA分子に脱保護およびTBDMS処理を行い、精製処理を行うため、純度の高いsiRNAが得られます。合成した各1本鎖RNAは2本鎖siRNA形態をとるよう、相補鎖RNAとアニーリングします。

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【02】 デザイン済みsiRNAのご注文方法

デザイン済みのAccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNAは、ヒト、マウス、およびラットに、ノックダウン効果検証済のAccuTarget ™ Validated siRNAはヒトに対応しています。対象遺伝子情報は、Symbol, GeneID、RefSeqアクセッション番号、またはDescriptionをもとにご検索ください。検索結果として、予測効率スコアもしくは検証実験結果とともに3種のsiRNA配列をご提示致します。精製度および最終収量も同時に品番にてご指定ください。ご注文方法の詳細は製品情報掲載ページでご確認いただけます。

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【03】 納期の目安

ご注文頂いたAccuTarget™製品により納期が異なります。カスタムsiRNAオーダーの場合、納期は約2〜3週間をお願いしています。AccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNAもしくはAccuTarget ™ Validated siRNAの場合、1〜2週間でお届け致します。ライブラリー製品や96-wellプレートを10プレート未満ご注文頂いた場合は1〜2週間、それ以上の容量または分量をご希望の際は、ご注文の都度確認させて頂きます。

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【04】 Bioneer社での最大合成鎖長

50merまでの1本鎖RNA合成を承ります。siRNAの場合、オーバーハングを含めて30merまで同一の価格帯です。30merより長鎖のsiRNAをご希望の際は、お問い合わせください。

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【05】 納品形態

Bioneer社設計のsiRNA製品は、センス/アンチセンス両鎖を等モル濃度合成し、MALDI-TOFにて確認後、アニーリングし、この2本鎖を凍結乾燥した状態でご提供します。ご希望の緩衝液や超純水に再溶解し、100μMの濃度とすることをお勧めしています。
カスタムsiRNAの場合、上記と同様の処理を行いますが、50μMに再溶解されることをお勧めします。Bioneer社のsiRNA製品は通常アニーリング済で納品されますので、アニーリングをご利用にならない場合にはご注文書の備考欄にその旨をご記載いただき、商品に添付の1x annealing bufferとアニーリングプロトコールを用いてアニーリングを行ってください。

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【06】 in vitro実験の場合、どの合成スケールと純度を選択すべきか。

siRNAを10nmolスケールでご注文頂いた場合、96穴プレートに各ウェル100nM濃度で100プレート分トランスフェクションできます。in vivo実験をご予定でない場合、Bio-RP精製で十分な結果が得られます。in vivo実験用にはHPLC精製をお勧めします。

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【07】 キメラRNAは合成可能か。

可能です。dA, dC, dGおよびdTのDNA塩基を組込んだキメラRNA合成も承っています。2'-O-Methylや2'-F(rU, rC)の組込みも可能です。キメラRNAをご希望の際は、詳細確認のため事前にご連絡ください。

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【08】 1遺伝子に対して4種類以上のsiRNAを希望する場合のご注文方法

ゲノムワイドデザイン済みsiRNAでは、1遺伝子に対して3種類のsiRNAをご提供します。4種類以上のsiRNAをご希望の場合、カスタムsiRNAとしてご注文ください。siRNA配列のご確認は正式なご注文を承った後になります。既報のsiRNA配列との比較やご注文の変更をご希望の場合はご連絡ください。

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【09】 ゲノムワイドデザイン済みsiRNAが期待通りに機能しない。

Bioneer社では、同一遺伝子に対して3 種類のsiRNA をご購入頂いた場合、このうち2 種類のsiRNA において標的mRNA レベルを少なくとも80% 抑制することを保証しています。もしも80% 以上の抑制効果が見られなかった場合、さらに2本のsiRNA を無料でご提供致しますのでご連絡ください*。

* 保証条件
ノックダウン効果保証をご利用頂く場合には、バイオニア社へ下記をはじめとした実験データをご提供頂く必要があります。

  1. siRNA ノックダウン効果のデータ:NC(AccuTarget™ネガティブコントロール)およびsiRNA 濃度100nM によるもの
  2. トランスフェクション効率データ:PC( AccuTarget™ GAPDH/GFP/Luciferase siRNA)、NC( AccuTarget™ Fluorescein 修飾つきネガティブコントロール)
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【10】 合成siRNAの5'末端または3'末端にリン酸基がついているか。

特別に明記していない限り、5'末端または3'末端は-OHグループでキャッピングされています。5'リン酸キャップされたsiRNAをご希望の場合は、5'リン酸化修飾をご指定ください。

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B. 修飾siRNA

【01】 修飾siRNAの種類

siRNAを広範に使用できるよう、修飾siRNAをご用意しています。siRNAの修飾方法は種々ありますが、最も簡便な方法としてsiRNA合成時にホスホラミダイトを利用するものがあります。5'末端修飾の場合、合成開始は平時と同様に行い、最終段階で標識ホスホラミダイトを5'末端に付加することで5'末端修飾siRNAが生成します。3'末端修飾の場合は若干複雑で、支持体に結合した標識ホスホラミダイトを用いて合成を始め、各分子をつなげていきます。5'末端デオキシウリジンの標識ホスホラミダイトにご希望の修飾基を組込むことで修飾siRNAが得られます。修飾siRNAを合成する場合にはHPLC精製合成が必要になります。

Bioneer社でご提供しているsiRNA修飾

  • 5' Amine - 3' amine modification
  • 5' Phosphorylation & 3' phosphorylation
  • 5' Thiol - 3' Thiol Modification
  • 5' Biotin - Internal Biotin-dT Modification
  • 5' Fluorescein - 3' Fluorescein modification
  • 3' TAMRA modification
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C. お取り扱い方法および保管方法

【01】 siRNAの保管方法と保存期間

一般に、siRNAは-20℃で1年以上安定です。凍結乾燥した状態では特に安定で、長期保存が可能です。ただし、再溶解したsiRNAは安定ではあるものの、再溶解液がRNaseに汚染されていた場合などはsiRNA崩壊の要因となります。凍結融解の繰返しもsiRNA崩壊を引き起こします。凍結融解を避けるため、siRNAを入手された際は、再溶解後、複数の容器に分注することをお勧めしています。pHが高い条件ではRNAのホスホジエステル結合が崩壊する可能性があるため、pHに注意すると同時に添付の超純水に再溶解することをお勧めしています。

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【02】 siRNAの再溶解方法

siRNAを溶液の状態で保存することをご希望の場合、RNAの安定性を考慮してBioneer社のDEPC処理水を用いてRNAを再溶解することをお勧めしています。
品番:C-9030 品名:DEPC-Treated Water 包装:500ml 希望販売価格:¥12,000

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【03】 蛍光修飾済みsiRNAの保存方法

蛍光修飾siRNAを長期にわたり光に曝すと光退色が生ずる場合があります。遮光容器に入れ暗いところで保存してください。

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D. 精製

【01】 合成siRNAの精製方法

新規合成したsiRNAはBio-RP, HPLCおよびPAGEなどにより精製します。お客様にご指定頂いた方法で精製を行います。

Bio-RP: Bio-RP合成機でsiRNA合成を行う場合、合成中に生ずる2次的な反応から5'末端を保護するDMT基をもつホスホラミダイトを使用します。DMT基が合成サイクル終了時(トリチル付加設定)に除去されない場合、目的鎖長のN-mer siRNAのみ5'-DMT基を有し、期待する鎖長より短鎖(N-1, N-2など)の副産物にはDMT基をもちません。DMT基は疎水性が非常に高いためRP樹脂と干渉します。この性質および副産物の完全長ではないsiRNAはDMT基をもたないことを利用して、期待するN-merのsiRNAを精製します。in vivo実験をご予定でない限り、Bio-RP精製によるsiRNAで優れた実験結果が期待できます。
HPLC: in vivo実験のような高純度のsiRNAが要求される実験の場合、Bio-RP精製では十分な純度が得られない可能性があります。期待する純度を得るため、HPLC精製を行うことが一般的です。Bioneer社では逆相樹脂を使用しており、21-mer siRNAにおいて、通常最大98%の純度を得ています。siRNAをin vivo実験にご利用の際は、HPLC精製品のご利用をお勧めしています。
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E. 定量化と濃度

【01】 O.D.値とは

合成siRNAは非常に少量であるため重量による定量が困難です。そのため、核酸の吸光度特性を用いて間接的に合成産物の量を測定します。合成産物における光の吸収量をO.D.(Optical Density: 光学密度)値として示し、この値が溶液中に存在する合成産物量と相関性をもちます。

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【02】 O.D.値からsiRNA濃度の算出方法

波長260nmにおけるsiRNAの吸光度を測定し、下記の式を用いてsiRNA量を算出します。

O.D. = εC
ε:吸光係数(各物質に特異的な数値)
C:siRNA濃度

吸光係数とO.D.値が既知の場合、siRNA濃度を求めることができます。siRNAの吸光係数は、対象siRNAを構成する各塩基の吸光係数の和となります。波長260nmにおける各塩基の吸光係数は下記をご参照ください。

rG : 11.5 ml/ μmole
rC : 7.2 ml/μmole
rA : 15.4 ml/μmole
rU : 9.9 ml/μmole

したがって全siRNAの吸光係数は、各塩基の吸光係数に塩基数をかけた後、これらを足し合わせたものになります。

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【03】 18-mer siRNA(3G, 4C, 5A, 6G)のO.D.値が0.7である場合のsiRNA量

全siRNA分子の吸光係数(εε)をまず算出します。

ε= 11.5 x 3 + 7.2 x 4 + 15.4 x 5 + 9.9 x 6 = 199.7 [mL/μmole]
O.D. = εC より
C = 0.7 /199.7
= 0.0035 [μmole/mL]
= 3.5 [nmole/mL]

製品購入時に商品に添付されるオリゴ合成報告書では、この数値を「total nmole value」と表記してあります。

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【04】 合成siRNA分子の分子量算出方法

下記の数式にsiRNA内の各塩基数をあてはめて分子量を算出します。

M.W. = (NA x 329.208) + (NC x 305.183) + (NG x 345.207) + (NU x 306.168) - 63.98) + 2.016
NA:rAの全数量
NC:rCの全数量
NG:rGの全数量
NU:rUの全数量

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【05】 合成製品の重量は報告書に記載されるか?

保証したnmole量をご提供するため、合成報告書にも最終容量をnmoleで表記しています。実験時にngの重量情報が必要な場合、下記数式を用いてnmoleからngを算出できます。

Molecular Weight (g) X mole (nmole) = Mass of siRNA (ng)

合成報告書にsiRNAの分子量を記載していますので、ご利用ください。

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【06】 目的濃度にする方法

合成報告書に記載の「volume for 100 pmole/μL」値が、100pmole/μL濃度にするために必要なDEPC処理水量を示しています。例えば、2種類のsiRNAにおいて「volume for 100 pmole/μL」値がそれぞれ100と200であった場合、それぞれ100μLまたは200μLのDEPC処理水に再溶解することで最終濃度100 pmole/μLの溶液が得られます。この場合、各チューブに含まれるsiRNA量は下記通りです。

100 μl x 100 pmole/μl = 10,000 pmole = 10 nmole,
200 μl x 100 pmole/μl = 20,000 pmole = 20 nmole

siRNA濃度は使用するDEPC処理水量によって決まりますが、一般的な使用方法では100pmole/μL濃度が適当であると考えています。そのため、100pmole/μL濃度にするためのDEPC処理水情報をご提供しています。

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【07】 モル濃度とモル数の変換方法

オリゴマーの標準的な濃度単位はM [mole/L]で示し、単位の範囲を示すためμ(マイクロ)、n(ナノ)、p(ピコ)などを付けます。濃度だけでなく鎖長や質量などにおいても下記のプレフィックスが使用されています。

10-1 = deci [d],  101 = deca [da]
10-2 = centi [c], 102 = hecto [h]
10-3 = milli [m], 103 = kilo [k]
10-6 = micro [μ], 106 = mega [M]
10-9 = nano [n], 109 = giga [G]
10-12 = pico [p] ,1012 = tera [T]
10-15 = femto [f], 1015 = peta [P]
10-18 = atto [a], 1018 = exa [E]
10-21 = zepto [z], 1021 = zetta [Z]
10-24 = yocto [y], 1024 = yotta [Y]
1 pmole/μL = 1 x 10-12 [mole] /1x10-6 [L]
= 1 x 10-6 [mole/L]
= 1 x 10 [μmole/L]
= 1 μM

したがって、μMとpmole/μLは同一の意味をもちます。

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F. 実験

【01】 siRNA実験において注意すること

まず、全てのsiRNAが標的遺伝子に対して同等のノックダウン効果を示すわけではありませんので、2?3種類のsiRNAを試してノックダウン効率の高いsiRNA配列をみつける必要があります。次に、mRNAのノックダウンによりタンパク質発現が影響を受けるはずですが、mRNAレベルの測定は必要です。さらに、標的遺伝子のノックダウンにより表現型が生じた場合、異なるsiRNA配列を用いて同様の表現型が再現できるか確認することが重要です。

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【02】 siRNA実験初心者です。実験条件の設定方法は?

siRNA実験において最も重要なことの1つにsiRNAが細胞に送達されたか評価することがあります。Bioneer社ではsiRNAのトランスフェクションが良好に行われたかの標識となるポジティブコントロールをご提供しています。

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【03】 siRNAトランスフェクションにはどの程度の細胞密度が適するか。

一般に、約60〜70%の細胞密度でsiRNAトランスフェクションを行うことをお勧めしています(HeLa細胞の場合、6穴プレートで1.5 x 105 cells/well)。ただし、お客様の実験状況に準じて最適化されることを強くお勧めしています。

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【04】 トランスフェクションに使用するsiRNA濃度

100nM(100pmol/well)を初期条件とすることをご提示していますが、ご利用の細胞株や実験条件に応じて、最適化してください。

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【05】 10nmoleのsiRNAを使って100nMで細胞にトランスフェクションするにはどうすればよいか。

頻繁にご質問頂く点です。ご使用のウェルのサイズよりトランスフェクションに1mLの溶液が必要な場合、100nMのsiRNAをトランスフェクションするためには100pmoleのsiRNAが必要です。2μLの50μM(50 pmole/μL)のsiRNA保存溶液をトランスフェクション溶液に加えて1mLとした場合が100nM(100 pmole/mL)です。もし、10nmoleのsiRNAをご購入頂きました場合、100nM(100 pmole/mL)濃度で100ウェルにトランスフェクション可能です。

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【06】 どのトランスフェクション試薬を使用するべきか

各トランスフェクション試薬により、各細胞株に対するトランスフェクション効率が異なるため、ご利用の細胞株に適したトランスフェクション試薬をご選択頂くことをお勧めしています。
サンプル提供可能な試薬も多数ご用意しておりますので、こちらをご参照ください。

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【07】 siRNAトランスフェクション効率の確認方法

トランスフェクション効率の確認には 、蛍光修飾つきネガティブコントロール を使用細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡で観察する方法があります。蛍光修飾つきネガティブコントロールはsiRNAおよびトランスフェクション試薬の使用濃度の条件設定にご利用頂けます。

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【08】 入手したsiRNAのノックダウン効率を事前に確認する手段

Bioneer社のRNAi 製品専用WEB サイトで検索した特定のsiRNA番号をクリックすると予想されるsiRNAノックダウン効果が確認できます。検証済みsiRNA効果は青色で、予測されるsiRNA効果は灰色で表記してあります。

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【09】 siRNA実験用コントロールの種類

AccuTarget™ Negative Control siRNA は、全ての既知ヒト、マウス、ラット遺伝子に対して相同性が低いことを確認済みのノンターゲットsiRNAです。ヒト、マウス、ラット何れの実験においてもネガティブコントロールとしてご利用頂けます。AccuTarget™ Positive Control siRNAs(human) は標的遺伝子に対して高いノックダウン効果を示すことを確認済みです。内在性遺伝子のGAPDHを標的するポジティブコントロールsiRNAとGFPやルシフェラーゼといったレポーター遺伝子を標的するものをご用意しています。

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【10】 siRNAノックダウン効果の検証方法

siRNAノックダウン効果はqPCR、ノーザンブロット、ウェスタンブロットをはじめとしたいくつかの手法を用いて検証できます。

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【11】 AccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNAsについて

AccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNAは、Bioneer社がKRIBB(Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)と共同開発したsiRNAデザインアルゴリズム「Turbo si-Designer」を用いてデザインしたsiRNAコレクションです。この革新的なアルゴリズムを用いて、ノックダウン効率の高いAccuTarget™ Genome-wide Predesigned siRNAデータベースを作成しました。現時点で、Bioneer社のウェブサイトにはヒト(17,842遺伝子)、マウス(17,117遺伝子)、ラット(9,392遺伝子)に対するデザイン済みsiRNA情報を登録しています。

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【12】 AccuTarget™ validated siRNA とは。

Bioneer社がKRIBB(Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)と共同開発したsiRNAデザインアルゴリズム「Turbo si-Designer」を用いてsiRNAデザインを行い、siRNA合成後、定量PCRによりノックダウン効果を確認したものが「AccuTarget™ validated siRNA」です。各siRNAが70%以上のノックダウン効果を示すことを確認済みです。AccuTarget™ Validated siRNAをご注文の際は、リアルタイムqPCRプライマーセットも同時にご注文頂けます。10種類以上のsiRNAをご注文の際は、フレキシブルでお得なsiRNAライブラリー形態にて納品致します。

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【13】 特定遺伝子を標的とするsiRNAを入手可能か。

お客様の標的遺伝子に対するsiRNAは、遺伝子名またはアクセッション番号にてBioneer社のRNAi 製品専用WEB サイトで検索頂き、定時される3配列よりご選択ください。モデル動物がヒト、マウス、ラット以外の場合には、カスタムデザインsiRNAとしてご依頼頂く必要がございますが、提示される3配列をすべてご購入頂く必要がございます。

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【14】 siRNAを使用上の注意点

  • siRNAを扱う際には手袋とマスクを装着すること
  • RNaseを含まないチューブおよびピペットチップを使用
  • siRNAの希釈にはDEPC処理水を使用すること
    品番:C-9030 品名:DEPC-Treated Water 包装:500ml 希望販売価格:¥12,000
  • 蛍光ラベル済みsiRNAは暗所保存すること
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