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Q&A:Bellbrook Labs社 受託キット Transcreener® ADP FP Assay

Q1. Transcreener® ADP FP Assay Kit とは?

A1. 本受託キットに含まれるもの
ADP抗体、ADP Far Red Tracer、Stop and Detect Buffer、500 μM ADP
お客様にご用意頂くもの
キナーゼ、基質、キナーゼ反応液
ご利用初期ATP濃度10uM以下用と11uM〜100uM用でそれぞれ1000アッセイ分の評価用サイズをご用意しております。


 

Q2. Transcreener® ADP FP Assay Kit はどのようなキナーゼにも利用できますか?

A2. キナーゼの種類に関わらず利用可能です。本アッセイはユニバーサルなアッセイであり、一般的に使用されているキナーゼバッファーを用いることで、精製したチロシンおよびセリン/スレオニンプロテインキナーゼに適用することが可能です。本アッセイの利用性は広く、実際に、どのようなADP合成反応にでも適しています。


 

Q3. Transcreener® ADP FP Assay Kit は、どのタイプの基質に利用できますか?

A3. 本アッセイは、すべてのキナーゼ反応で生成されるADPの一般的な検出に基づいているので、理論上、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、糖、脂質を含む、どのような種類(また、ほとんどの濃度)の基質にも利用できます。カスケード経路(例;MAPKシグナル経路)に含まれる、リン酸化されたタンパク質およびペプチド、不活性化タンパク質もまた、本アッセイに適応すると考えられます。


 

Q4. Transcreener® ADP FP Assay Kit を使用するには、どのような機器が必要ですか?

A4. 本アッセイには、2.0nMの蛍光ラベル化合物を十分に測定できる感度をもつ蛍光偏光測定器が必要です。以下に、本アッセイに対応する機器とフィルターセットを示します。

Instrument ex filter em filter Dichroic
Tecan Ultra or GenIos 612 pol (bw=10) 670 (bw=25) Cy5
Tecan Safire2 590 (LED) 670 (bw = 20) NA
Mol Dev. Analyst 640 (bw = 22)* 680 (bw=20)* 650 (Cy5)*
PE Victor2v 605 (bw=55) 665 (bw=10) NA
PE Envision 620 nm, 10 nm
(code 118)
Cy5 FP S&P-Pol
(code 247-8)
Cy5 FP dual
(code 488)

*Chroma社 品番31023をご利用ください。

 


 

Q5. どのようなマイクロタイタープレートを使用すればよいですか?

A5. Corning® Microplates, Part # 3676(384 well, black, round bottom, low volume, polystyrene, non-binding surface)が本アッセイに適しています。Bellbrook Labs社では全てのプレートをテストしている訳ではありませんが、非結合表面または低結合表面のプレートはキナーゼ反応の効率を高めるので、キナーゼ反応中に生成されるADPの検出にお勧めです。また、0.01% Brijをキナーゼ反応液に加えると、タンパク質のプレートへの固着を最小限にすることができます。


 

Q6. 標準曲線の作成方法とその理由は?

A6. ADP/ATP標準曲線は、mP値をADPの量(μM)に換算するために作成し、それによりATPからADPへの変換率を求めることができます。ADP/ATP標準曲線はアデノシン濃度を一定に保った状態(ADP生産とATP消費が平衡している状態)のキナーゼ反応と類似した形をとります。


 

Q7. ADP/ATPに対するこのアッセイの選択性はどのようになっていますか?

A7. 本アッセイで使用される反応条件下では、ADP抗体は、ADPに対してATPの100倍の選択性をもっており、ロバストアッセイに十分です。しかしながら、感度やアッセイウィンドウを最大限にするためには、ADP抗体濃度を初期ATP濃度ごとに最適化する必要があります。


 

Q8. Transcreener® ADP FP Assay Kit で使用可能なATP濃度の範囲は?

A8. 本アッセイは、初期濃度1-500μM ATPで測定可能です(最高濃度でテスト済み)。


 

Q9. 添加剤またはバッファーの違いによるTranscreener® ADP FP Assay のパフォーマンスへの影響は?

A9. Transcreener® ADP Assayは、多くの添加剤やバッファーに影響されないことが確認されています。


 

Q10. 検出可能な変換率 (ATP->ADP)は?

A10. Z’値0.5以上とするためには最低限10%の変換率が必要とされます。


 

Q11. ADP抗体が、試験化合物、特にヌクレオチドアナログに結合する可能性はありますか?

A11. 試験化合物がトレーサー/抗体複合体を直接阻害することは、理論上可能です。しかしながら、Bellbrook Labs社のデータから、トレーサーと抗体との間に非常に特異的な相互作用があることが示されています。


 

Q12. なぜトレーサーの蛍光プローブとしてAlexaFluor™ 633を選択しているのですか?

A12. 蛍光検出の際には、化合物自体の自己蛍光や不溶性の化合物による光散乱の影響を受ける可能性が考えられます。これらの影響は、赤色にシフトされた蛍光プローブを用いることにより軽減されます。本アッセイは、一般的な機器に対応しているAlexaFluor™ 633 fluorを利用しています。


 

Q13. 非生産性ATP加水分解については考慮するべきですか?これはバックグラウンドシグナルとして影響しますか?

A13. あるキナーゼは、自己リン酸化によりATP加水分解を触媒します。しかし、その比率は一般的に、基質がない場合は低く、基質が存在するときはさらに減少します。もし潜在的な基質のスクリーニングを行う場合には、自己リン酸化によるATP加水分解由来のバックグラウンドを考慮するため、非生産性ATP加水分解の検出には、“基質なし”のコントロールをお勧めします。


 

Q14. キナーゼやタンパク質基質に混在する不純物はTranscreener® ADP FP Assay に影響を及ぼしますか?

A14. 本アッセイは生成されたADPに対して検出を行います。したがって、キナーゼ、ホスファターゼまたはATP加水分解によるADP合成に関与する不純物は、目的とするキナーゼ活性の正確な測定を妨げる可能性があります。キナーゼやタンパク質基質の調整の際には、不純物混入の可能性を最小限にするようご注意ください。