FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　アデノ随伴ウイルス（AAV）精製キット

CBL社の精製キットは、AAV-2 の AAV2Cap タンパク質の構造を基にしたアフィニティーマトリックスを用います。それゆえに、AAV-2 と AAV-DJ のみに使用可能で、他のセロタイプの精製には適していません。他のセロタイプは超遠心で精製を行うことができます。

AAV精製キットを用いる3つの利点があります。

1. CBL社の精製キットは退屈な超遠心と比較し、簡単です。
2. 超遠心は、単に部分精製と考えられウイルスの精製というよりは粒子の濃縮と言えます。CBL社のキットは超遠心と比較して in vivo での使用に有利なより高い精製度のウイルスが得られます。
3. CBL社の AAV 精製キットは、60% 以上の高収率です。一方で超遠心は、約 40% の収率です。

CBL社の精製キットは少なくとも上清のウイルスの 60% が回収できます。精製キットを使用して得られる最終的なタイターは、精製する前の AAV ライセートのタイターに主に依存します。キットが働くには、そこにウイルスが無くてはなりません。精製の前の AAV 産生の最適化はとても重要です。トランスフェクション条件の最適化で、精製前に 15cm ディッシュから、1-2×10¹¹ GC を得ることができます。

CBL社では AAV 精製キットとして、“スタンダード” と “メガ” の2つをご用意しています。これらのキットの違いは、精製されるスタートの材料の量です。スタンダードキット（品番： VPK-140）は、プレップあたり2枚の 10cm ディッシュの上清（ペレットを 2.5mL の PBS に再懸濁する）を精製するように設計されています。メガキット（品番： VPK-141）は、10枚の 15cm ディッシュの上清を 25mL にアップし、取り扱うことができます。ウイルスの上清の量で、適したキットを選択してください。

このキットを用いたウイルスは結果として、少なくとも 95% 精製度で超遠心よりも高精製です。このキットを用いて精製された AAV は in vivo でご使用いただけます。

AAV 精製キットの全ての溶液が滅菌されているわけではありません。CBL社ではサンプルの滅菌が必要であれば、キットを使用した後、フィルター滅菌していただくことをお奨めしています。

接着細胞の回収は必要です。剥離溶液が必要となります。CBL社のプロトコルでは EDTA を用いており、トリプシンを代わりに用いることが可能です。

マトリックスは1回しか使用できません。

精製された AAV に 5-10% グリセロールを添加することで安定性が増しますが必要ではありません。グリセロールは AAV サンプルを in vivo で使用するのを妨げます。もし、in vitro のアプリケーションのみでしたら問題ありません。CBL社では、AAV は凍結融解を避けるために小分けにすることをお奨めします。ウイルスは -80℃ で1年間は安定でしょう。

AAV 精製キットの使用にあたって、2つの重要なポイントがあります。

1. 精製の前に AAV のタイターを測定します。これらのキットのウイルスの回収率は少なくとも 60% で、最終のタイターは、主に精製する前の 293AAV ライセートのクルードのタイターに依存します。
2. 細胞ペレットは、ウイルスのリリースをするための凍結融解サイクルの前に、血清フリーの培地に再懸濁しなくてはなりません。