FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　ROSアッセイキット

主な違いは用いられるサンプルです。セルバイオラボ社の Intracellular ROS Assay (品番： STA-342)　のサンプルは培養細胞です。細胞透過性の DCFH-DA が細胞に添加され、細胞内エステラーゼにより DCFH になります。一旦、ROS による酸化が起こると、DCFH は、蛍光を発する DCF になります。このアッセイは、DA 基を取り除くためにエステラーゼ活性が必要となりますので、生細胞及び組織のみに有効です。In Vitro assay (品番： STA-347) は、エステラーゼ活性の必要がなく、細胞膜を透過するための染色剤の必要がありません。

本キットが働くには、DCFH-DA が生細胞を透過することができ、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化されることが必須です。バクテリアでは試験していませんが、DCFH-DA が細胞を透過できるので使用できると考えられます。バクテリアに DCFH-DA を用いた文献も出ています。

Cell Biolabs（セルバイオラボ／CBL）社の ROS アッセイキットを使用している大部分の研究者は、処理したものと処理していない (ROS の刺激剤または阻害剤で処理した) サンプルを蛍光値で相対的に比較しています。したがって、たとえそれが技術的に本来のネガティブコントロールでなくても、処理していない細胞は、ベースラインのコントロールと考えられます。処理の結果は、処理していないサンプルと比べて何倍変化したかを比較します。

このアッセイは、培養細胞の ROS を検出し、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーで読むことができます。細胞をブラックプレートで培養すれば、ライセートを調製する必要はありません。

生産された ROS と結合すること、ROS に起因する変化を捉えるために、ROS を細胞に処理を施す前に、DCFH を加えることが重要です。細胞の内部で、DCFH-DA は細胞エステラーゼにより加水分解され DCFH になり、細胞内でトラップされます。ROS による酸化が起こると、非蛍光の DCFH が蛍光の DCF に変換されます。内在性の ROS が細胞内で継続的に生産されるため、DCFH-DA 染色液を細胞に加えた後1時間以内にご自身のドラッグで細胞を処理する必要があります。ドラッグによる処理を行う際、継時的にドラッグの影響をモニタリングするために、細胞をブラックプレートで培養することを推奨します。クリアプレートで培養する場合は、蛍光を観察する際、ブラックプレートに移しかえる必要があり、サンプルにつき1点しか測定することができません。

メーカーでは ROS 産生を誘導するために、HeLa 細胞を 100μM –1mM 過酸化水素で1時間処理しています。しかし、異なる細胞は異なる処理時間や投与量を必要とするかもしれません。いくつかの細胞は、濃度が高すぎると毒性を示すかもしれません。

プロトコルでは、このアッセイは1時間のインキュベーション時間で行われると記載されています。しかし、結果は、使用する処理剤に依存します。　このタイプの実験では、継時的にご自身の細胞を分析できるように、ブラックプレートに細胞を播種することを推奨します。ご自身の処理剤を細胞に加える前に、DCFH を細胞に加えることが重要です。

72時間アッセイすることに関しては試験していませんが、DCFH は安定ですのでおそらく問題ないでしょう。もし、長時間のインキュベーションによって分解が始まったら、蛍光の減少を見ることになるかもしれません。しかしそれは均一な分解であるべきで、サンプル間を相対的に比較することは可能です。ドラッグによる効果を継時的に観察するためにブラックプレートで細胞を培養する方が良いでしょう。

はい。Intracellular ROS Assay (品番：STA-342) は、細胞タイプに依存せず、ROS を検出します。

はい。Intracellular ROS assay kit (品番：STA-342) は、接着細胞と浮遊細胞どちらにも使用することができます。浮遊細胞は、ラベル方法は同じで、1×DCFH-DA で、37℃、30-60分間インキュベートします。そして、DPBS で余分な染色液を除きます。浮遊細胞を洗浄するために、細胞をスピンダウンし、DPBS でペレットを洗浄します。

細胞がメタノール感受性である場合、染色液を終濃度 0.1-0.01× となるように希釈してください。アッセイにおける希釈した DCFH-DA の量は、変更する必要はありません。0.1× 希釈でも感度に影響を与えず、蛍光プレートリーダーで読むことができます。しかし、0.01× 希釈は、プレートリーダーで検出するには薄すぎるため FACS で読む必要があります。

一旦、DCFH が ROS/RNS と反応して DCF となると、それは安定です。反応は非可逆的です。

DCF 蛍光は、ROS レベルに正比例しますが、このキットは ROS スタンダードカーブを使用しないため特異的な ROS の値と RFU 値を相関させることは不可能です。スタンダードカーブは、定量的な結果を出すためのものではなくアッセイが上手く行っているかを確認するものになります。

セルバイオラボ社では固定細胞で試験したことがなく、どのような影響がアッセイに出るか分かりません。また、固定によって酸化のプローブである ROS が誘導されるか、固定された細胞内で ROS が産生されないかについては分かりません。 もし倒立顕微鏡をご使用でしたら、反応を止めることなく継時的に顕微鏡下で直接観察することができ、細胞を固定する必要はありません。

このアッセイで使用される染色剤は、光感受性で光に曝されると自動的に酸化します。もし高いバックグラウンドがあるならば、オプションとしてバッファーを除き、新しいバッファーに交換してください。顕微鏡で光を照射し観察する場合は、蛍光の増加を避けるために、できるだけ早く観察することが望ましいです。