FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　ニトロチロシンELISA

3-ニトロチロシン(3-NT)の構造は、何のサンプル由来のタンパク質ライセートに存在するかに関係なく同じであるため、#STA-305は、種特異性はなく、3-NTを含むどんなサンプルにも使用できます。

血清または血漿サンプルのどちらも使用できます。このキットの3-NTスタンダードカーブは広範囲で、大部分の血清および血漿サンプルの3-NTレベルを網羅していますので、これらのサンプルは、希釈せずに直接プレートに加えることができます。もし、スタンダードカーブからサンプルの値が外れてしまった場合、アッセイ希釈液を使用して希釈サンプルを調製することができます。

#STA-305の細胞または組織ライセートサンプルの調製に使用するライシスバッファーに制限はありません。RIPAバッファーなどの界面活性剤ベースのライシスバッファーは、このアッセイに適しています。セルバイオラボ社で使用しているライシスバッファーは下記の通りです。

* Tris 50mM, pH 7.5
* NaCl 150 mM
* NP40 1%
* PMSFまたはプロテアーゼインヒビターカクテルなどのプロテアーゼ阻害剤

いいえ。血清サンプルは直接プレートに加えることができます。

セルバイオラボ社のニトロチロシンELISAキットは、競合ELISAで、サンプルはプレコート済みプレートに添加されるため、サンプルのタンパク質濃度は、重要ではありません。サンプルの3-NTレベルに依存しますので、このニトロチロシンキットに使用するサンプルのタンパク質濃度のおすすめはありません。このキットの3-NTスタンダードカーブは、広域(1.95-8000 nM　ニトロチロシン) でほとんどのサンプルの3-NTレベルを網羅していますので、スタンダードの範囲内に3-NTレベルは収まると考えられます。希釈なしのサンプルから始め、もし、スタンダードの領域を超えた場合、アッセイ希釈液を使用してサンプルを希釈することをおすすめします。

違いは、このELISAのフォーマットです。#STA-305は、競合ELISAで、サンプルをプレコートされたプレートに加えるためインダイレクトELISAのようにサンプルのタンパク質濃度は重要ではありません。インダイレクトELISAは、サンプルをプレートにコートし、タンパク質濃度は各ウェルにおいて一定に維持する必要があります。このニトロチロシンELISAキットのおすすめのタンパク質濃度は、各サンプルの3-NTレベルに依存するので、ありません。

このキットの3-NTスタンダードカーブは広範囲で、大部分の血清および血漿サンプルの3-NTレベルを網羅していますので、サンプルの値がスタンダードカーブの範囲から外れる可能性は極めて低いと考えられます。希釈なしのサンプルから始め、もし、スタンダードの領域を超えた場合、アッセイ希釈液を使用してサンプルを希釈することをおすすめします。

#STA-305は、競合ELISAで、タンパク質サンプルはニトロ化BSAプレコート済みプレートに添加されます。プレートに結合したタンパク質とサンプルが競合し、抗体に結合するため、逆のカーブを生成します。3-NTレベルの低いサンプルは、プレートに抗体がより結合し、高いシグナルとなります。

スタンダードカーブから濃度を決定するための最良の方法は、4-PLカーブフィッティングプログラムを使用することですが、ソフトウェアを持っていない場合は、Excelを使用することができます。スタンダードカーブをプロットする場合、X軸を対数スケールにし、直線または対数近似曲線を作成します。ELISAのスタンダードカーブは通常、直線にはなりませんが、サンプルが残ったポイントの間に収まる限り、高濃度と低濃度の値をカーブから除くことで直線のカーブを作成することができます。スタンダードの中間の部分は最も感度が良く、サンプルを定量するのに使用する一番良い部分です。

もし、サンプルがスタンダードカーブの範囲より高かったならば、アッセイ希釈液でサンプルを希釈し、サンプル量は50μLを維持してください。もし、サンプルがスタンダードカーブの範囲またはバックグランドレベルより低かったならば、そのサンプル中のニトロチロシンレベルがこのキットの検出限界よりも低いことを意味します。

このニトロチロシンELISAキットは、KLH-ニトロチロシンコンジュゲートを使用して作成されたウサギポリクローナル抗体を使用しており、遊離または結合3-NTのどちらも認識します。

このELISAで使用されている抗体は、遊離、結合ニトロチロシンの両方を認識します。それゆえに、このキットは、遊離3-NTまたはタンパク質サンプルに含まれるニトロチロシンの両方に使用することができます。