FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　In vitro ROS/RNS アッセイ

主な違いは適用サンプルです。Intracellular ROS アッセイ（品番：STA-342）は、培養細胞をアッセイします。細胞透過性のDCFH-DAは、細胞に添加され、細胞内エステラーゼによって加水分解され、DCFHとなります。一旦、ROSによって酸化されると、DCFHは、蛍光のDCFとなります。DA基を除去するのにエステラーゼ活性を必要とするため、Intracellular ROS アッセイは生細胞または組織から調製した生細胞に対してのみ有効です。

一方、In Vitro ROSアッセイ（品番：STA-347）は、細胞/組織ライセート、血液、尿に使用されます。In Vitro ROSアッセイキット（品番：STA-347）は、活性型のエステラーゼと染色液が細胞膜を透過する必要がありません。

セルバイオラボ社では、酵母細胞ではテストしていませんが、文献によると、酵母細胞でDCFHを使用し成功している研究者もいるようです。このアッセイは、テストする前に、細胞を溶解する必要があります。

このアッセイは、蛍光プレートリーダーが使用可能である限りROSを測定するための組織サンプルの使用に適します。製品マニュアルは、組織ライセートのためのサンプル調製のガイドライン(1×PBS中で、組織をホモジナイズまたはソニケートする)を含みます。ROSの一時的性質により、新鮮なサンプルを使用することをおすすめしますが、凍結組織は、-80℃で2ヶ月以上凍結させなければ使用できるでしょう。

このキットは、組織または細胞ライセートに適していて、生細胞に対して行う必要がありません。ROS/RNSは、半減期が非常に短く、もし固定された細胞されたら、より不安定になります。このことより、セルバイオラボ社では、固定された細胞のこのアッセイへの使用は推奨しません。

大部分のセルバイオラボ社のROS アッセイキットを使用している研究者は、処理したサンプルとそうでないサンプルの相対的な蛍光を測定しています。(サンプルは、ROSの刺激剤または阻害剤のどちらかに暴露されます。)　技術的には、真の?Negative"コントロールではありませんが、処理されていない細胞をベースラインコントロールとします。結果は、未処理のサンプルに比べ何倍かを報告します。

In Vitro ROS/RNS アッセイは、-80℃で1-2ヵ月凍結したサンプルを用いることはできます。これ以上長くサンプルを保存することはおすすめできません。可能であれば、新鮮なサンプルをご使用ください。例えば、長期間保存されているサンプルであれば、安定な酸化損傷マーカーである8-OHdGまたは4-HNEを選択してください。

In Vitro ROS/RNSアッセイは、サンプルに存在するトータルのフリーラジカルを検出します。製品マニュアル中で示されている過酸化水素など他のフリーラジカルを含みます。ROSは外部の酸化ストレスによって生産され、サンプル調製時にも誘導される可能性はあります。セルバイオラボ社のROSアッセイは、ROS産生の源を識別しませんが、ROSダメージレベルの増加は、サンプル調製方法によるものであれば、同等であると推測されます。サンプル調製によるROSレベルは、重要でなく、すべてのサンプルのバックグラウンドと考えられます。サンプルにROSが追加されることを懸念されるようでしたら、Intracellular ROS アッセイ(品番：STA-342)は、培養細胞中のROSを測定しますので、サンプル調製でのROSの生成を避けることができます。

アッセイはタンパク質濃度よりもサンプル中のROSレベルに依存しますので、サンプルの希釈の推奨は提供しておりません。サンプルタイプ、サンプル調製技術、保存条件により影響を受けます。サンプルがスタンダードカーブの中央に入るようにサンプルを希釈する必要があるか決定するために、実験を行う前にスタンダードカーブに対してサンプルを滴定することをおすすめします。例えば、希釈なし、1：2,1：10,1：20で希釈したサンプルを試します。希釈をしたとしても、サンプル容量はウェルに対し50μL加えてください。

サンプルのROSレベルに依存し、サンプル調製技術やサンプル保存条件などの影響を受けるので、アッセイに必要な最小量を提供するのは難しいです。サンプルがスタンダードカーブの中央に入るようにサンプルを希釈する必要があるか決定するために、実験を行う前にスタンダードカーブに対してサンプルを滴定することをおすすめします。 別の酸化ストレスマーカーである8-OHdG ELISA キット(品番：STA-320) を使用することを考えることができます。8-OHdGはとても安定で、尿サンプルで簡単に検出できます。

In Vitro ROS/RNSアッセイ(品番：STA-347)は、サンプル中に存在する過酸化水素や製品マニュアルに記載されているフリーラジカルも同様に、トータルフリーラジカルを検出します。過酸化水素は、優先的なフォームで、他のラジカルを除外し、一つに単離する方法はありません。製品マニュアルのグラフは、それぞれの化合物特異的に使用し作成されていますが、サンプルないで区別することは不可能です。サンプルの大部分のROSが過酸化水素に由来するものであるので、これは過酸化水素スタンダードと比較することができます。DCFスタンダードは、一般的にサンプル中の全てのフリーラジカルを測定する際に使用され、過酸化水素スタンダードは、サンプル中の過酸化水素レベルを測定するのに使用されます。アッセイが適切に行われていることを確認するために、過酸化水素スタンダードを作製することをおすすめします。

DCFスタンダードカーブはオプションで、プレートリーダーが正しく働いているかまたはダイが様々な濃度で検出されるかを確認するために使用されます。DCFスタンダードは、アッセイプロトコルを経由することがなく、サンプル中のフリーラジカルの値を与えることができません。過酸化水素スタンダードカーブは、ROSの優先的なフォームであり、サンプル中の検出される主なシグナルであるため、より有用です。

サンプル間で相対的に比較したい場合は、DCFスタンダードを用いるのは良いでしょう。DCFスタンダードカーブは、サンプル中の全てのフリーラジカルの目安ではなく、DCFの値は意味のないものです。よって、結果をDCF(nM)で表すのは良い考えではないでしょう。もし、結果を絶対値で表したいのであれば、過酸化水素スタンダードカーブを用いるべきで、サンプル中の過酸化水素量が反映されます。

いいえ。DCFスタンダードを使用する場合、触媒またはDCFHのいずれかをスタンダードのウェルに加える必要はありません。DCFスタンダードが調製されれば、それは完了で、直ちに読むことができます。触媒とDCFH溶液は、H2O2スタンダードを含むご自身のすべてのサンプルのウェルに添加されるべきです。