FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　8-isoprostaglandin F2alpha ELISA

このキットは、スタンダードのレンジである49 pg/mLと200,000 pg/mLの間の8-isoprostaneを認識します。

ヒト血清中の通常8-isoprostane レベルは、40-100 pg/mLで、ヒト尿中は、500-2000 pg/mLです。

このキットのプレートは、96ウェルストリップウェルプレートですので、必要なストリップを使用し、残りは後の使用のため保存することができます。スタンダードカーブはその都度測定する必要があります。

EDTAは、このアッセイを干渉せず、どんな抗凝固剤も血漿サンプルの調製に使用できます。

このアッセイに用いる細胞または組織ライセートの調製は、プロテイナーゼインヒビターを含む1×PBSで懸濁し、オプションで0.005 % ジブチルヒドロキシトルエン(Sigma社のものを使用、メタノールで5%ストックを作製)を加えます。ホモジナイズし、12,000×gで10分間遠心し、上清をライセートとします。

残念ながら、ライセートを調製する際の推奨の細胞数はありません。なぜなら、サンプルの8-isoprostane レベルに依存するからです。セルバイオラボ社の推奨は、最も濃いサンプルから始め、小さなスケールでスタンダードカーブを用いて滴定し、必要であれば希釈していくことをおすすめします。

アルカリ加水分解は、エステル型isoprostane を遊離するのに使用されます。

この8-isoprostane ELISAキットのサンプル調製で固相抽出ステップは、必要ありません。固相抽出を行う主な理由はリポタンパク質複合体からisoprostaneを遊離させることですが、セルバイオラボ社のプロトコルでは、サンプルを酸(尿サンプル)か塩基(組織、血清、血漿サンプル)のどちらかで処理することにより行われます。このキットでは、isoprostane特異的な抗体を用いており、他の脂質には反応しないので、固相抽出する必要がありません。

pHの低いサンプルはアッセイを干渉します。もしサンプルのpHが中性でないならば、ELISA中での抗体と抗原の結合が最適に行われないので、酸性化ステップに続いてPBSまたはサンプル希釈液で少なくとも1：4から1：8にサンプルを希釈しなければなりません。必要れあれば、希釈したサンプルのpHをpHストリップを用いて中性になるまで確認してください。

典型的なELISAと同様に、デヴェロップメント時間は変化しますので、インキュベーション時間には幅があります。TMB基質を加えると、ゆっくりと青色に変わっていきます。停止液を加えると黄色に変わります。サンプルの基質溶液を加えたインキュベーション時間が長すぎると、飽和してしまいます。停止液を加えるタイミングを決めるために、スタンダードカーブのウェルのうち、最も低い濃度のスタンダードが鮮やかに青色になり、最も高い濃度のスタンダードがわずかに色づいたところを注目します。良い色の勾配が見られたら、停止液を加え、直ちにプレートで測定してください。サンプル間の色付きの違いをなくすために、マルチチャンネルピペットを用いて全てのウェルに同時に停止液を加えることが重要です。

スタンダードカーブから濃度を決定するための最良の方法は、4-PLカーブフィッティングプログラムを使用することですが、ソフトウェアを持っていない場合は、Excelを使用することができます。スタンダードカーブをプロットする場合、X軸を対数スケールにし、直線または対数近似曲線を作成します。ELISAのスタンダードカーブは通常、直線にはなりませんが、サンプルが残ったポイントの間に収まる限り、高濃度と低濃度の値をカーブから除くことで直線のカーブを作成することができます。スタンダードの中間の部分は最も感度が良く、サンプルを定量するのに使用する一番良い部分です。