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記事ID : 12968

FAQ : Cytoskeleton(CYT)社 G-LISA™ RhoA 活性アッセイキット(比色法)について

【01】 G-LISA? 活性アッセイを使用して、RhoA/Rac1/RalA 以外のアイソフォームを検出することはできますか?

はい。RhoA G-LISA™ (品番: BK124)、Rac1 G-LISA™ (品番: BK128)、RalA G-LISA™ (品番: BK129) は、それぞれ RhoB/RhoC、Rac 2/Rac3、RalB の検出に使用できます。ウェルにコートされたキャプチャータンパク質が、各 GTPase の全てのアイソフォーム結合します。シグナルの特異性は、使用するモノクローナル一次抗体の特異性によって決まるため、アイソフォーム特異的なモノクローナル抗体を使用することで、Rho ファミリーアイソフォームを検出することができます。この方法を使用した例については、下記文献を参照してください。

Hall et al., 2008. Type I Collagen Receptor (α2β1) Signaling Promotes Prostate Cancer Invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10, 797-803

一般的に、目的のアイソフォームの特異性を証明する場合には、まず、特異的なモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロットを行います。例えば、RhoB モノクローナル抗体を使用する場合は、ネガティブコントロールとして RhoA と RhoC をロードします。次に、活性化およびコントロールサンプルの細胞抽出物(デュプリケート)に、モノクローナル抗体を 1:50、1:200、1:500 に希釈して使用します。活性化:コントロールの比が最大になるモノクローナル抗体の希釈倍率を決定します。

活性化/コントロール状態の細胞抽出物を簡単に作製するには、まず、血清含有培地で細胞を 50% コンフルエントに増殖させます。PBS で2回洗浄し、ライセートを調製して分注し、液体窒素でサンプルを凍結します。分注した内の1つを、解凍して室温で60分静置し、活性化シグナルを低下させてコントロールの状態にします。未処理のサンプル(分注した内の2つめ)は、血清で増殖した細胞が最も多く含まれる「活性化」状態であると考えられます。

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【02】 溶解ステップでは、同時に何枚の細胞培養プレートを扱えますか?

氷上でプレートに溶解バッファーを加えて分注し、液体窒素でライセートサンプルを凍結するまでを、10分以内に行うことを推奨します。氷上で10分経過すると、GTP が GTPase(活性化 GTPase)に結合し、急速に加水分解されることがわかっています。正確で再現性のある結果を得るには、4℃で速やかに処理することが重要です。下記のガイドラインを参照してください。

【洗浄】

a. インキュベーターから培養ディッシュを取り出し、直ちに培養液を全て吸引し、氷上に置きます。

b. 血清タンパク質を除去するために、直ちに細胞を氷冷した適量の PBS で洗浄します(Cdc42 の活性化にはこのステップをとばして、培養液の吸引のみ行ってください)。

c. 残った PBS バッファーを全て吸引します。溶解バッファーが希釈されることを防ぐために重要です。PBS を完全に除去するために、ディッシュを氷上に角度をつけて1分間置き、余分な PBS を集めて吸引してください。上述したように、細胞を溶解してから、ライセートをウェルに添加するまでの時間が非常に重要です。下記に注意してください。

  1. 速やかに作業を行ってください。
  2. 4℃以下に保つために、溶液やライセートは氷中に埋め込んで保存してください。経時的なシグナル変化を最小限に抑えることができます。
  3. 細胞ライセートは、回収・調製後、直ちに凍結することを強く推奨します。20 μL 以上のサンプルを氷上で保存し、タンパク質濃度を測定します。ライセートは液体窒素で凍結し、-70℃ で保存してください。-70℃で保存したライセートは、30日以内に使用してください。
  4. G-LISA™ アッセイに使用する細胞ライセートは、室温のウォーターバスで解凍した後、速やかに氷上に移し、直ちにアッセイに使用してください。
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