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Q&A

記事ID : 13619

FAQ : ATUM(DNA)社 CRISPR/Cas9ゲノム編集ツールについて

【01】 CRISPR/Cas9技術でどんなことができますか。

CRISPR-Cas9技術の利用により、挿入欠失変異を介して対象ゲノムの特定位置へ希望の遺伝子をノックインしたり、遺伝子発現のノックアウトをすることができます。

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【02】 CRISPR/Cas9技術を自分が対象とする宿主で利用できますか。

ATUM社では哺乳動物と酵母システムを対象とした商品を上市しています。現在、大腸菌をはじめとする複数の宿主システムでの開発を、主に共同研究を通じて進めています。お客様のシステムで利用可能なCRISPR/Cas9の開発プロジェクトも実施致します。
ご希望がございましたら、お問合せください。

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【03】 NickaseNinja™とは何ですか。

NickaseNinja™は全てを持ち合わせたベクターで、ニッカーゼ改変型Cas9をこのタンパク質の機能に必要な2つのgRNAsとともに発現します。

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【04】 NickaseNinja™の注文方法を教えてください。

現時点では、NickaseNinja™はATUM社のクローニングサービスとしてご希望のgRNAsをATUM社で組込済のコンストラクトとしてのみご提供しており、空ベクターののご提供はしておりません。お客様のカスタムデザインgRNAsをベクターにクローン致します。
本サービスにつきましては、コスモ・バイオ(株)カスタマー・サービス部 へお問い合わせください。

【ATUM 社 カスタムサービスお問い合わせ先】
TEL:03-5632-9616 FAX:03-5632-9614
E-mail:dds_info@cosmobio.co.jp

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【05】 ATUM gRNAデザインツールの使い方を教えてください。

ご希望の遺伝子または配列情報をご入力頂くと、デザインツールが入力配列内の全てのCas9標的部位を同定します。結果には予測される特異性を基にした標的部位の順位リストがついています。本プログラムで使用しているアルゴリズムはNGGとNAGスペーサー後隣接モチーフ(PAM)の前に位置する12塩基のシード配列の出現率に基づいています。
操作方法は、デモンストレーションの動画をご参照ください。

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【06】 挿入欠失頻度を教えてください。

挿入欠失頻度は、標的遺伝子配列の挿入と欠失の比率で計測されます。挿入欠失は標的部位における短鎖の挿入または欠失で、宿主細胞におけるCas9/gRNAによる切断とこれによる非相同末端結合(NHEJ)により生ずると考えられます。NHEJは小さな変異(挿入または欠失;挿入欠失)を導入するため、Cas9/gRNAによる切断が回避されます。ATUM社では、Cas9/gRNAに曝露後、12-24コロニーを用いて対象領域をPCRし、切断部位を含めて配列決定します。その後、無修正の野生型配列を対照として、切断部位における変異率または挿入/欠失を下記の通り算出します。
挿入欠失頻度 = 挿入欠失/野生型 x 100 [百分率として]

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【07】 通常どのような挿入欠失がみられますか。

最も一般的なのは1塩基欠失です。短鎖挿入をはじめ1-10塩基の欠失も経験しています。論文等では1-10塩基の挿入や欠失が報告されています。

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【08】 新規DNA配列の最大挿入サイズを教えてください。

宿主により異なります。特定の宿主における最大挿入サイズは変化しない(その宿主に関する文献情報に準ずる)と思われます。CRISPRではこれらの現象を効率的に行うことができるため、選択マーカーを利用しなくても遂行可能です。本プロセスは現在より効率的になっており、最大挿入配列を少し大きくできるかもしれません。ただし、ご利用の宿主においてご確認頂く必要がございます。

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【09】 陽性細胞の選択方法を教えてください。

CRISPRの効率は非常に高いため、選択を行う必要がありません。ATUM社では通常12-24クローンを選択して増殖し、配列決定により選別します。通常、最低1つから10のクローンが遺伝子ノックアウトを導くのに適切なフレームシフト変異を含んでいます。抗生物質マーカーをご利用頂くことも可能ですが、CRISPR効率は非常に高く、マーカーを必要としないゲノム編集が一般的かつ通常期待される手法です。

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