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Q&A

記事ID : 17872

FAQ:HansaBio(HNB)社 エクソソームスタンダード

商品詳細

【01】 エクソソームとはどのようなものですか?

エクソソームは、脂質二重膜に囲まれた細胞外小胞です(直径30-120 nm)。細胞より分泌され、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液等の体液にみられます。

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【02】 エクソソームとマイクロベシクル(microvesicle)は異なるものですか?

エクソソームとマイクロベシクルは大きさの違いで分けられます。(エクソソーム 直径30-120 nm、マイクロベシクル 直径100-1000 nm)また、エクソソームとマイクロベシクルでは細胞表面抗原が異なり、細胞間コミュニケーションや遺伝子交換において異なる役割を果たします。

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【03】 エクソソームスタンダードはどのように調製されていますか?

超遠心分離およびマイクロフィルトレーションによって回収したエクソソームを安定化処理し、凍結乾燥しています。エクソソームスタンダードは、ウェスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリー、電子顕微鏡観察などの様々なアプリケーションにご使用いただけます。

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【04】 凍結乾燥により小胞の形や収量は変化しますか?

凍結乾燥は小胞の形に影響を及ぼしません。凍結乾燥エクソソームは4℃保存で3年間安定です。

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【05】 エクソソームスタンダードを水で溶解後、どのように保存すれば良いですか?

溶解後は、-20℃で1か月間 または -80℃で1年間は安定です。凍結融解は避けてください。

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【06】 なぜPBSではなく、水で溶解するのですか?

バッファーに懸濁したエクソソームを凍結乾燥しているため、水で溶解した場合に適切なバッファー組成に戻ります。希釈が必要な場合は1×PBSで希釈をすると、RNA/タンパク質抽出、qPCR、TEMアッセイ、ウェスタンブロット、細胞表面ラベリングなどの様々な実験にご使用いただけます。

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【07】 Plasma Exosome Standardsとはどのようなものですか?

健常人ドナー由来のプール血漿から、超遠心分離およびマイクロフィルトレーションにより単離したエクソソームです(凍結乾燥品)。

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【08】 ウェスタンブロットに使用する際のサンプル調製方法を教えてください。

ポリアクリルアミドゲルの1レーンにつき、15-20 ?gのエクソソームをアプライしていただくことをお勧めします。100 ?gの凍結乾燥エクソソームに対し100 ?Lの水を添加し、1 ?g/?Lのエクソソーム溶液を調製します。必要であれば、2-メルカプトエタノールまたはDTTを還元剤として添加します。CD63やCD9などのテトラスパニンを解析する際、還元処理は必ずしも必要ではありません。ターゲット分子およびご使用される抗体の特性をご確認のうえ、ご検討ください。

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【09】 細胞死はエクソソーム解析に影響を及ぼしますか?

はい、細胞死はエクソソームの分泌に影響を及ぼします。従って、健康な生細胞をエクソソーム研究にご使用いただくことをお勧めします。また、アポトーシス細胞はアポトーシス小体を分泌するので、注意が必要です。

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【10】 細胞あたりのエクソソーム収量はどのくらいですか?

エクソソーム収量は細胞種、コンフルエンシー、培養条件(成長因子の有無)、培養期間、エクソソーム径の均一性などの様々な要因により変化しますので、一概には言えません。

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【11】 アポトーシス小体、マイクロベシクル、エクソソームをどのように見分ければ良いですか?

各小胞を特徴化するには、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、プロテオーム解析(MS解析)、電子顕微鏡観察、原子間力顕微鏡解析などが有用です。アポトーシス小体を含む比較的径の大きい小胞については、蛍光免疫染色にて解析を行います。粒径分布解析には、Nanosightや動的光散乱法がよく使用されます。

NanoSight は、Malvern Instruments 社の商標または登録商標です。

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【12】 エクソソーム単離用のコンディション培地の推奨保存方法を教えてください。

エクソソームの単離には新鮮なサンプルをご使用いただくことをお勧めしますが、コンディション培地を4℃で保存することも可能です。4℃保存では、一週間までは、エクソソームやマイクロベシクルに大きな変化を与えることなく保存できます。長期間保存する場合は、-80℃で保存いただくことをお勧めします。

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【13】 精製したエクソソームを凍結保存できますか?凍結保存はエクソソームの構造に影響を及ぼしますか?

エクソソームは新鮮な状態で取り扱うのが理想的ですが、精製したエクソソームを -80℃で保存することも可能です。繰り返しの凍結融解を避けるため、精製したエクソソームは、凍結前に分注していただくことをお勧めします。エクソソームの膜は細胞膜とは異なりエンドソーム膜に由来するため、膜に安定性をもたらす、リン脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、テトラスパニンなどが多く含まれています。しかしながら、凍結融解はエクソソームの形態に影響を及ぼす可能性があり、動的光散乱解析、ナノトラッキング解析、バイオアッセイ、電子顕微鏡観察を行う際は注意が必要です。

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【14】 血清サンプルを保存する際に保護剤としてDMSOを添加する必要はありますか?

DMSOは細胞を凍結する際の保護剤としてよく使用されますが、エクソームの保護にはお勧めしません。エクソソームのサイズは細胞と比較し小さく、液体含量も少ないためです。

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【15】 エクソソームに含まれるタンパク質量はどのように測定すればよいですか?

エクソソームタンパク質は、エクソソームを溶解後、Bradford法 または BCA法で測定します。エクソソーム中のタンパク質濃度(?g/?L)が得られます。

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【16】 がん細胞のエクソソーム分泌を阻害することは可能ですか?

Dimethyl amiloride(DMA)、Sphingomyelinase 阻害剤(GW4869)、Glucosyl ceramide synthase 阻害剤(di threo-1- 1phenyl-2-de canoylamino-3-morpholino-1-propanol)は複数の細胞株でエクソソームの放出を抑制することが報告されています。また、Rab27遺伝子またはRab35遺伝子をRNAiによりノックダウンすることでエクソソーム分泌が減少することが報告されています(1)(2)

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(1) Peinado H, Aleckovic M, Lavotshkin S, Matei I, Costa-Silva B, Moreno-Bueno G, Hergueta-Redondo M, Williams C, Garc?a-Santos G, Ghajar C, Nitadori-Hoshino A, Hoffman C, Badal K, Garcia BA, Callahan MK, Yuan J, Martins VR, Skog J, Kaplan RN, Brady MS, Wolchok JD, Chapman PB, Kang Y, Bromberg J, Lyden D. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 2012 Jun;18(6):883-91. doi: 10.1038/nm.2753.

(2) Hsu C, Morohashi Y, Yoshimura S, Manrique-Hoyos N, Jung S, Lauterbach MA, Bakhti M, Gr?nborg M, M?bius W, Rhee J, Barr FA, Simons M. Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10A-C. J Cell Biol. 2010 Apr 19;189(2):223-32. doi: 10.1083/jcb.200911018.