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Q&A

記事ID : 14435

FAQ : Immunochemistry Technologies(IMT)社 FLICA® 660 カスパーゼ 3/7 アッセイキット(近赤外蛍光)について

【01】 FLICA® 660 カスパーゼアッセイは、どのくらいのサンプルを試験できますか?

FLICA® 660 カスパーゼ 3/7 アッセイキット(品番: 9125)には、細胞培養サンプル 7.5 - 15 mL の試験を行うのに十分な試薬が含まれています。
試験できる回数は、サンプル量、アプリケーション、preferred working 濃度によって変動します。一般的な推奨条件では、フローサイトメトリーは1バイアルにつき50回の試験、蛍光顕微鏡解析は1バイアルにつき25回の試験を行うことができます。

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【02】 1キットにつき、どのくらいの量の FLICA® working solution が含まれていますか?

FLICA® 660-DEVD-FMK カスパーゼ-3 検出プローブは、安定した凍結乾燥試薬として提供しており、使用する直前にDMSOに再懸濁し、PBSで working solution に希釈します。660-DEVD-FMK は、調製後すぐに使用できるFLICA® working solution (250 μL/バイアル) として提供しています。

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【03】 推奨する使用条件を教えてください。

FLICA® 660-DEVD-FMK working solution は、細胞懸濁サンプルに、1:30- 1:60 の比率で添加します。最適な比率は、アプリケーションや解析方法によって異なります。推奨条件に従った場合、FLICA® 660 1バイアルあたり 25-50 試験を行うことが可能です。サンプル量や染色濃度を変更する場合には、サンプルごとに使用する FLICA® の量が変わり、それに応じて1バイアルあたりの試験数が変動します。

  • フローサイトメトリーに用いるには、FLICA® 660-DEVD-FMK を 1:60 の比率で使用することを推奨します。
  • 顕微鏡解析には、フローサイトメトリーに用いる場合よりも、染色濃度の高い FLICA® 660-VAD-FMK が必要となる場合があります。そのため、FLICA® working solution を 1:30 の比率で使用することを推奨します。
  • サンプル量は 300 μL を推奨します。 2-5 x 10ˆ5 cells/mL に増殖させた培養細胞から分注してください。
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【04】 FLICA® 660 カスパーゼアッセイは、蛍光プレートリーダーを使用できますか?

機器を適切に設定することで、蛍光プレートリーダーを使用して、FLICA® 660 カスパーゼ検出試薬の遠赤色蛍光シグナルを検出できる場合があります。現時点では、プレートリーダー解析用の特定のプロトコールはありません。

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【05】 フローサイトメトリーの推奨条件

フローサイトメトリー解析用には、2-5 x 10ˆ5 cells/mL の細胞懸濁液に、FLICA® 660-DEVD-FMK working solution を 1:60 の比率で使用すると、アポトーシス細胞を十分に染色できる場合があります。
例)分注した細胞 300 μL に working solution 5 μL を添加。この例では、FLICA® 660-VAD-FMK 1バイアルにつき、50回の試験が可能となりますが、実際の試験数はサンプル量によって変動します。

far-red FLICA® 660-VAD-FMK のシグナル(最大蛍光波長: 680-690 nm)は、FL-4 チャネルで簡単に測定することができます。

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【06】 蛍光顕微鏡の推奨条件

蛍光顕微鏡解析は、フローサイトメトリー解析と比較すると、より高い細胞濃度(mL あたり)が必要になります。高倍率で視野内を適切に観察するためには、細胞を FLICA® 660-DEVD-FMK で染色する直前に、 2-5 x 10ˆ6 cells/mL の密度に遠心分離で濃縮してください。(培養細胞の初期濃度が 2–5 x 10ˆ5 cells/mL である必要があります。)

したがって、蛍光顕微鏡による解析では、高濃度の FLICA® 660-DEVD-FMK カスパーゼ-3 検出試薬が必要となります。FLICA® 660-DEVD-FMK working solution を、細胞懸濁液に 1:30 の比率で加えます。
例)分注した細胞 300 μL に、working solution 10 μL を加えます。この例では、FLICA® 660-DEVD-FMK 1バイアルあたり、25回の試験が可能となりますが、実際の試験数はサンプル量によって変動します。

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【07】 FLICA® はその他のカスパーゼアッセイとどのような点が異なりますか?

  • 細胞透過試薬により、画像化やフローサイトメトリーなどの全細胞解析が可能
  • 蛍光試薬やプローブを追加することで、フレキシブルなマルチパラメーター解析が可能
  • FLICA® カスパーゼアッセイキットは、生きた全細胞を使用でき、溶解や透過処理は必要なし
  • FLICA® カスパーゼアッセイは ELISA 法ではないため、抗体や基質を使用しません。活性カスパーゼ-3 酵素は、生細胞中で FLICA® 660-DEVD-FMK に結合するため、プロカスパーゼや溶解手順による干渉がありません。
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【08】 サンプルは標識後すぐに測定する必要がありますか?

すぐにサンプルを測定しない場合は、キットの固定液(品番: 636)でサンプルを固定し、遮光して、16時間以内に測定することを推奨します。

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