FAQ : GeneCopoeia（GCP）社 cDNAクローン製品について

ライフテクノロジーズ社（Invitrogenブランド）より、さまざまな形態のタンパク質（ネイティブ、N末端融合、C末端融合など）を細菌、酵母、昆虫、哺乳動物といった各種宿主細胞システムを用いて発現可能なpDEPT発現ベクター（destination vector）シリーズが発売されています。

現時点では、構築済みヒトおよびマウスORFクローンのみご提供しています。ラットなどの他のモデル動物由来の全長ORFクローンは現在構築中で、近日中に販売開始予定です。もし、これら生物種の特定遺伝子にご興味があり、かつ全長ORFをお持ちの場合、GenBankアクセッション番号や核酸配列などの情報をご連絡ください。GCP社の保有するベクターへのクローニングをカスタムで実施させて頂きます。GCP社では、ヒト／マウス遺伝子をお客様ご希望のベクターにクローニングするカスタムクローニングサービスも承っています。

プロモータ下流に正しいDNA配列を配置したからといってタンパク質が発現する保証はありません。タンパク質発現の成功／失敗には多数の要因が挙げられます。

１）タンパク質発現に使用した宿主に適した発現ベクターをご利用ですか？例えば、弊社のpReceiver-M01ベクターは哺乳動物細胞用、pReciver-B01は細菌用です。
２）膜性タンパク質の場合、適切に局在化させるための標的配列が必要ではありませんか？
３）過剰発現させたタンパク質が宿主に毒性を示していませんか？
４）機能や免疫分析に適切な、正しい３次元構造をとるようタンパク質が折り畳まれていますか？
５）核酸配列をシークエンシングで確認し、選択的スプライシングをうけたバリアントでないか確認されましたか？

pReciever-B01およびpReceiver-WG02/WG03/WG04/WG05/WG09/WG16のクローンは全て、E.coliまたはRoche社の無細胞タンパク質産生システムを用いて発現確認を行っています。ただし、種々の特色をもつその他の宿主細胞システムに対応する発現クローンに関してはタンパク質発現テストを行っていません。

本来のスプライシング形態のものをクローニングし、ご提供できるよう試みます。ただし、 特定のスプライシングバリアントをクローンできるかどうかは保証致しかねます点、ご了承ください。

このような件に関しては、残念ながら代替品をご提供することができません。一方で、特定核酸塩基をご希望の塩基に変換する変異誘発サービスを安価でご提供することは可能です。

GCP社のシステムでは、全長ORF産生のフィデリティがこれまでの約10倍程度に改善された最新の高いフィデリティをもつPCR用試薬を利用しています。さらに、テンプレートへの非特異的プライマー結合を避けるため、反応温度を下げるとともに増幅回数を最小に抑えています。リファレンス配列を参照として、GCP社のORF挿入配列にフレームシフトや早熟性の終止コドンがないことを保証しています。クローンに問題がある場合は代替品のご提供をさせて頂きます。

可能性として下記の２点が考えられます。

１）遺伝子多型、選択的スプライシング、アノテーションのアップデートにより同一遺伝子の複数コピー／バージョンによって情報が相違、シークエンシングでのエラーや曖昧性といった自然現象によるもの

２）PCRクローニングにより導入された人為的な変異。クローン購入をご検討頂いている方のなかには、わずか１つのリファレンス転写物の配列情報とGCP社のシークエンシングデータとを比較して、その原因がPCRによる変異であると結論づけるお客様も多くいらっしゃいます。GCP社では20,000種にもおよぶヒト遺伝子のそれぞれ複数クローンの分析を行ってきました。このGCP社のシークエンシングデータと、対応する遺伝子領域における全転写物とその配列、ゲノム配列、ESTおよび他のcDNA/mRNA転写物情報とを比較した結果、この相違が上述の（１）のケースである場合が大部分を占めることがわかりました。概して、パブリックドメインの転写物と対応するゲノム配列との相違に比べ、GCP社ORFクローンと対応するゲノム配列との相違は比較的少ないです。もちろん、PCRクローニング過程における変異導入を完全に除去することはできませんが、頻度としては低いと考えています。

全長ORFの作成は、PCRのフィデリティを最大限にするため、PCRと特許権を持つ複数の技術とを組合わせて行っています。PCRテンプレートにはヒトまたはマウス組織由来の70種のcDNAライブラリーを使用しています。

ORF EXPRESS? Shuttle clone用のシークエンシングプライマーは下記通りです。
フォワードプライマー（ORFの5'末端の上流）：5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
リバースプライマー（ORFの3'末端の下流）：5'-ATGGTCATAGCTGTTTCCTG OmicsLink? cloneのプライマー配列はGCP社ウェブページ をご確認ください。

ORF EXPRESS? shuttle cloneの生産過程で、お客様にご提供する各全長ORFクローンのシークエンシングを行います。出荷前に遺伝子特異的プライマーを用いたPCRにより再度確認し、正しいクローンをお届けすることを心がけています。

ご指定の遺伝子をクローン致します。GCP社では、全てのヒト遺伝子の全長ORFをクローンすることを使命として努力しています。ご希望の遺伝子が既にGCP社の生産工程に入っていたり、予定に入っていたりする可能性もありますので、GenBankアクセッション番号、遺伝子名、核酸またはアミノ酸配列をご連絡ください。該当遺伝子をクローニングする優先度が高い遺伝子として対応させて頂きます。通常、クローニング作業自体は２〜３週間で完了するものの、該当遺伝子を確実に得る保証は致しかねます。クローン構築が完了次第、直ちにご連絡致します。費用は見積依頼フォームよりお問い合わせください。

各遺伝子座には、選択的スプライシング、ORF情報のアップデート、遺伝子多型、複数の研究室からの報告による重複といった理由により複数の転写物が報告されています。ORFクローニング用に全長遺伝子を選択する過程では、各遺伝子座において最も典型的な転写物をGCP社にて選択しています。しかしながら選択した情報が遺伝子によっては若干または著しく異なる可能性もあり得るという点をご理解頂きたく存じます。一方で、この手法を用いることで広範な全遺伝子座に対応できると考えています。GCP社でのクローン製造過程で、多くの場合、複数のバリアントやバージョンの全長ORFが得られています。特定のバリアント／バージョンの遺伝子／ORFをご希望の際は個別にお問い合わせください。
場合によっては、新規配列情報や実験的事実を受けてアノテーションが変更され、これにともないORFの開始や終止位置が変更したために相違が生じることもあります。GCP社の通常業務の一環として、NCBIやEMBLといった公共のデータベースにおけるORFアノテーションアップデート情報を適宜確認しています。新しいORFアノテーション情報を元に再クローニング工程へ進め、ORFクローンが最新情報に準ずるようにしています。

違います。GCP社WEBサイトに掲載の配列情報はクローン自身の配列ではなくNCBIのリファレンス配列です。実際のクローン配列は遺伝子の多様性や選択的スプライシングなどにより異なる可能性があります。ORF cDNAクローンの実際の配列はご要望に応じてe-mailにてご連絡致します。ただし、構築が終了していないクローンやカスタム遺伝子合成により構築したものなど、ご提供できる状態にない場合もあります。

ORF EXPRESS? Gateway? Shuttle CloneおよびOmicsLink? Expression Cloneの何れにおきましても、全長ORFクローンの種類によってMCS配列が異なります。クローンの製品添付書をご参照頂き、参考図をもとに配列をご確認ください。

図１　Catalog No. GC-B0128のMCS模式図例

アンピシリンまたはネオマイシンです。OmicsLink? Expression Cloneをご購入の際にご確認ください。

カナマイシンです。

OmicsLink? Expression Cloneは特許権をもつRecJoin?クローニング技術を用いて製造しています。この技術を用いて5'末端タグとORFの融合タンパク質発現クローンを構築した場合、5'タグと全長ORFの開始コドン（ATG）の間にはattB部位が存在しません。ライフテクノロジーズ社InvitrogenブランドのpDEST発現クローンに存在するattB部位由来の８アミノ酸配列は、 OmicsLink? Expression Cloneを用いて発現させたタンパク質には存在しません。

融合ペプチド（またはN-末端タグ）とORFをコードするタンパク質間に14のアミノ酸配列が存在します。このアミノ酸は。N末端からC末端側に向けて「Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Leu Gly Gly Val Arg Thr」です。8つのアミノ酸（Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly）はattB組換え部位にコードされ、残りの６つ（Leu Gly Gly Val Arg Thr）はattBと開始コドン（ATG）間の配列由来です。

各ORF EXPRESS? Shuttle CloneにはORFを挟んで２つのマルチクローニングサイト（MCS）があります。適切な制限酵素を選択すれば、ORFEXPRESS? Shuttle CloneからORF全長を切り出し、お手持ちのベクターに従来のサブクローニング手法で組込むことができます。

ポイントミューテーションを入れることで終止コドンを除くことができます。35,000種以上の全長ORFが3'末端タグ付きで構築してあります。 eGFPやHAを始めとする10種類以上からお選び頂けます（OmicsLink? Expression-Ready ORF cDNA Clone）。GCP社では、終止コドンの除去とご希望のベクターへのクローニングを安価で承っています。見積依頼フォームよりお問い合わせください。

２つの方法があります。

ひとつはGCP社のOmicsLink? Expression Cloneを使う方法です。GCP社では既にN末端またはC末端タグ付き発現ベクターを用いたORFクローンを数々構築しています。HisタグやeGFPなど10種類以上からお選びください。

次に、ライフテクノロジーズ社Invitrogenブランドの Gateway?発現ベクターを使ってN末端またはC末端融合タンパク質を発現させる方法があります。弊社のORF EXPRESS? Gateway? Shuttle Cloneには終止コドンが入っていますので、ライフテクノロジーズ社のpDEST発現ベクターを用いてC末端タグ付き融合タンパク質を発現させる場合は、ORF配列を組込む前に終止コドンを取り除く必要があります。

選択過程は非常に厳密に行います。複数の公的または私的情報源からの遺伝子配列およびアノテーション情報を抽出後、比較、検証を行うといったことなどを行います。重複を避けるとともに誤った遺伝子を除去するためにクラスター形成やマニュアルでのキュレーションも行います。

GCP社にて製作したORF EXPRESS? Gateway? Shuttle Cloneは、attL1とattL2の組換え部位の間に全長ORFがクローンされており、attR1/attR2組換え部位もつGateway? pDEST発現ベクターと組換え可能です。適切な酵素濃度かつ条件下で、GCP社のORF EXPRESS? Gateway? Shuttle CloneをGateway?と互換性のあるpDEST発現ベクターとを混合すると、ORF EXPRESS? Gateway? Shuttle CloneにクローンされているORFをGateway? pDEST発現ベクターに移動できます。ベクターの組換え部位がもつ特有の性質から、移行したORFは、その発現ベクター（destination expression vector）のプロモーターに制御されます。

全長ORFクローンにはタンパク質コード配列のみを含んでいます。その他の全長cDNA/転写物には5'/3' UTRといった非翻訳領域の配列の配列が含まれ、この領域はタンパク質への翻訳工程において好ましくない影響を与えることが知られています。これら２種類のクローンを比較した詳細情報 はこちらをご参照ください。

全長ORF（Open Reading Frame）クローンは、全長タンパク質をコードするDNA配列をもつプラスミドです。DNA挿入配列は、全長遺伝子/cDNAのうち、タンパク質コード配列（開始コドンから終止コドンまで）のみをもち、5'/3'末端の非翻訳領域（UTRs）やイントロンは含みません。