FAQ : Genlantis（GEN）社 GenePORTER™ （DNAトランスフェクション試薬）について

GenePORTER? 及び GenePORTER? 2 トランスフェクション試薬は、様々な細胞で高いトランスフェクション効率を得られる、多価陽イオン性脂質です。細胞毒性が低く、安定性に優れており、使いやすい試薬です。

GenePORTER? トランスフェクション試薬は、一般的にトランスフェクションに用いられる様々な細胞（HEK293、COS-1、COS-7、B16-F0、Jurkat 細胞など）で、血清フリーのトランスフェクションを効率的に行うことができます。GenePORTER 試薬は、非常に毒性が低く、接着細胞と浮遊細胞の両方に最適です。GenePORTER? 2 試薬は、PC-12、マクロファージ、初代培養細胞などの、トランスフェクションが困難な細胞で特に有効です。GenePORTER? 2 試薬は、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、優れた安定性が特長です。血清成分との相互作用は最小限に抑えられているため、GenePORTER?2 試薬は血清含有培地でのトランスフェクションに最適です。

GenePORTER? トランスフェクション試薬の正に帯電した第一級アミノ基は、プラスミドDNA、RNA、オリゴヌクレオチドなどの負に帯電したリン酸骨格と静電気的に相互作用します。形成された DNA/GenePORTER? 複合体は、正味の正電荷（推奨条件下）を持ち、負に帯電した細胞膜に結合します。その後、複合体は、エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれます。

GenePORTER?／GenePORTER? 2 トランスフェクション試薬は、接着細胞（例： COS、NIH-3T3、MCF-7）と浮遊細胞（例： Jurkat、MDCK、K-562）、初代培養細胞と不死化細胞、それぞれ両方に適しています。ユーザーに継続的な調査を行い、これまでに GenePORTER? 試薬を用いてトランスフェクションに成功した100以上の細胞を確認しています。

GenePORTER? 2 の「DNA 希釈液」と新しい「DNA 希釈液 B」には、それぞれ異なる細胞でのトランスフェクション効率を向上させる、独自の成分が含まれています。２種類のDNA 希釈液を使い分けると、幅広い細胞で最高のトランスフェクション効率を得ることが可能です。GenePORTER? 2 プロトコールには、一般的にトランスフェクションに使用される細胞16種類について、使用する DNA 希釈液の表が記載されています。研究に使用する細胞が表に載っていない場合は、新しい「DNA 希釈液 B」から始めることを推奨します。

GenePORTER? 試薬の「トランスフェクション反応 1回」は、6ウェルプレートの1ウェル 又は 35mm ディッシュを使用して DNA 2 ?g を導入する、と定義しています。GenePORTER? 試薬のトランスフェクション条件は、培養用ディッシュの表面積や容量ではなく、播種する細胞数に基づくことに注意してください。製品に付属のプロトコールを参照してください。

通常、レポーター遺伝子アッセイは、トランスフェクション開始後 24-72 時間で行うことが可能です。しかし、非常に分裂が遅い細胞に GenePORTER? 試薬を使用する場合は、導入遺伝子産物についてアッセイする前に、少なくとも1回の細胞分裂を経ることを推奨します。

まず、目的の遺伝子を組み込むベクターが、高発現を目的に最適化されている（例： phCMV、gWIZ ベクター）ことが重要になります。ベクターが最適化されていない場合は、遺伝子発現量が低下します。
次に、トランスフェクション効率は、DNA の量 及び GenePORTER? 試薬と DNA の比率を調整すると向上する場合があります。

【GenePORTER? トランスフェクション試薬】

接着細胞：
まず、DNA 1 ?g に対して GenePORTER? 3-9 ?L を使用して、GenePORTER?/DNA の最も高効率な比率を決定します。比率を最適化するために、使用する DNA 量を少なくしてください。最適な比率を決定後、提示した範囲内でDNA 量の検討を行います。この時点で、細胞数を最適化することも可能です。

浮遊細胞：
接着細胞と同様に最適化を行いますが、接着細胞より GenePORTER?/DNA の比率を高くします。DNA 1 ?g に対して GenePORTER? 6-14 ?L を使用してください。

【GenePORTER? 2 トランスフェクション試薬】

接着細胞：
まず、GenePORTER? 2/DNA の比率を一定に保ち、提示した範囲内で DNA 量を検討してください。次に、必要があれば、DNA 1 ?g に対して GenePORTER? 2 3-6 ?L を使用して、GenePORTER? / DNA の比率を最適化してください。その後、細胞数を最適化することも可能です。

浮遊細胞：
接着細胞と同様に最適化を行います。

GenePORTER? 試薬は、オリゴヌクレオチドの導入用におすすめします（GenePORTER? 2 試薬でも使用実績があります）。GenePORTER? 試薬を使用すると、細胞内にホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを簡単に導入できることが示されています。また、GenePORTER? 試薬は、様々な哺乳動物細胞株で、20-mer から 80-mer のオリゴを導入するために使用されています。（注： GenePORTER? 試薬を、中性または正に帯電した DNA アナログと一緒に使用することは推奨しません。）

GenePORTER? トランスフェクション試薬を使用した参考文献のリストはこちらをご覧ください。

安定性を保つために、GenePORTER? 試薬キットは 4℃ で保存してください。適切な条件で保管した場合、乾燥状態の GenePORTER? 2 試薬は12ヶ月間、溶解した GenePORTER? 2 試薬は6ヶ月間安定です。溶解用バッファーと DNA 希釈液は、12ヶ月間安定です。

GenePORTER? と GenePORTER? 2 の細胞毒性は、通常の条件下では最小限です。実際に、細胞毒性が低いことを理由に、GenePORTER? 試薬を使用する研究者が多くいます。

GenePORTER? 試薬は、長期安定性を向上するために、乾燥脂質フィルムとして提供されます。脂質フィルムは基本的に肉眼では見えませんが、バイアルの中に入っています。プロトコールに従い、製品を溶解して下さい。（注： 溶解用バッファーをこぼした 又は なくした場合は、組織培養グレードの滅菌水で代用できます。）

GenePORTER?／GenePORTER? 2 トランスフェクション試薬は、直接筋肉注射 及び 腫瘍内投与を含む様々なマウスモデルにおいて、遺伝子発現を亢進させることが示されています。DNA/GenePORTER? 複合体を処方するための標準的なプロトコールに従ってください。また、下記の文献を参照してください。

Bogdanov, et. al. (2001) Gene Therapy 8, 515-522

GenePORTER? トランスフェクション試薬は、一過性（transient）及び 安定的（stable）トランスフェクションの両方に使用することができます。安定的（stable）トランスフェクションを行うためには、目的の遺伝子と一緒に、抗生物質耐性遺伝子をトランスフェクションする必要があります。トランスフェクション後に選択培地を添加すると、染色体に抗生物質耐性遺伝子が組み込まれた細胞のみ選択されます。

はい。GenePORTER? トランスフェクション試薬は、細胞内に複数のプラスミドを導入することができます。プロトコールに記載された条件は、トータルのDNA 量を示しています。従って、DNA 1ug に含まれるプラスミドが１種類でも10種類でも問題ありません。

はい。しかし、非分裂細胞で高いトランスフェクション効率を得るのは困難です。

一般的な多価陽イオン性脂質と同様に、GenePORTER?／GenePORTER? 2 試薬は、蛍光顕微鏡下で可視化される恐れのある固有の蛍光を有します。しかし、自家蛍光は通常最小限で、カメラで検出するには露出時間を長く（例： 1/4秒）設定する必要があります。対照的に、GFP蛍光は通常十分に明るいため、露出オーバーを防ぐために、露出時間を短く（例： 1/60 又は 1/120 秒）設定する必要があります。このような短い露出時間では、自家蛍光は通常可視化されないため、問題ありません。しかし、バックグラウンド蛍光がある場合でも、適切なコントロール（DNAのみ 又は GenePORTER? のみを細胞にモックトランスフェクション）が設定されていれば、GFP のシグナルと簡単に区別することができます。

DNA/GenePORTER? 複合体を細胞に添加した後、細胞の上に粗い砂のような沈殿物が認められる場合があります。これは、全ての脂質ベースのトランスフェクションで共通に観察される現象です。細胞の上の「沈殿物」は、静電気的相互作用を介して細胞表面に付着した DNA/GenePORTER? 複合体です。複合体が細胞表面と直接接触することで、目的 DNA の取り込みが行われます。

GenePORTER? / DNA 複合体は、毎回新しく作製する必要があります。プロトコールには、複合体を 45 分以内に使用するように記載されています。複合体は、長時間放置すると凝集して大きくなり、溶液中に沈殿しやすくなります。

BoosterExpress? 試薬と、GenePORTER? 2 キットの DNA 希釈液は、生物学的機能がかなり異なり、同等ではありません。DNA 希釈液は、DNA を圧縮するように設計されており、GenePORTER? 2 試薬を使用して効率的に導入が行えます。 対照的に、BoosterEXPRESS? 試薬は、遺伝子発現を増加する細胞培地添加剤として設計されています。細胞の DNA 取り込みを増加させるのではなく、細胞の代謝機構を刺激することで、遺伝子発現を増強します。BoosterExpress?　試薬による遺伝子発現の増加は、細胞の種類によって異なります。

はい。BoosterExpress? 試薬は、GenePORTER? トランスフェクション試薬と一緒に使用するために最適化されていますが、その他のトランスフェクション試薬と組み合わせて使用した場合も、導入遺伝子発現が有意に増加することが示されています。

DNA は、TE バッファー 又は 精製水に懸濁してください。DNA 濃度は 0.1 mg/mL が適しています。