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Q&A

記事ID : 12354

FAQ : Mabtech(MAB)社 ELISAについて

【01】 推奨のELISAプレートは?

ELISA においては、96-ウェルタンパク質高結合プレートをお奨めしています。組織培養プレートは、タンパク質結合量が少なく、適していません。ELISA プレートは、複数の製造元から販売されています。

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【02】 なぜ、血清・血漿サンプルは、特別な希釈液が必要なのですか?

ヒト血清・血漿サンプルは、キャプチャー及び検出抗体に結合し、アナライトと似たシグナルをもたらす異好性抗体を含んでいます。ELISA希釈液及びアッセイバッファーの使用は非特異的結合を減少させるので、血清・血漿サンプルの場合使用を強く推奨します。
ELISA analysis/Reducing unspecific signal guidelines をご参照下さい。

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【03】 異好性抗体とは?

異好性抗体は、ヒト血清・血漿で見られ、ELISA のキャプチャー及び検出抗体の両方に結合する能力があります。異好性抗体の存在は、大多数のヒトで見られ、アッセイに使用される抗体に交差し、偽陽性シグナルをもたらす結果となります。
ELISA analysis/Reducing unspecific signal guidelines をご参照下さい。

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【04】 どのようにサンプルを希釈するべきですか?

サンプルの希釈は、アナライトの濃度を推測しそれに適合させるべきです。もし、サンプルのアナライトの濃度期待値の情報があるのならば、スタンダードカーブのレンジがガイドラインとして使用できます。もしそうでなければ、幅広くサンプルを希釈し検討する必要があります。
ELISA analysis/ELISA sample dilution をご参照下さい。

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【05】 どのようにELISA スタンダードを希釈するべきですか?

ELISA プロトコルに掲載されているスタンダードレンジがスタンダードカーブのガイドラインとして使用されるべきです。スタンダードの希釈は、製品添付書のスタンダードレンジに従って行って下さい。スタンダードの希釈は、実験の30分より前に行わないで下さい。
ELISA analysis/ELISA standard をご参照下さい。

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【06】 デベロプメントタイプの基質が含まれていないキットに使用する推奨の基質は?

マブテック社では、ALP の基質としてpNPP を、HRP の基質としてTMB を推奨しています。これらの基質は、複数の製造元から販売されています。製造元推奨のハンドリングとリーディング波長に従って下さい。製造元の違いによる製品の違いによりシグナルの強度が変わります。ELISA の基質は可溶性である必要があり、ELISpot に必要とされるような沈殿性の基質は使用できません。
ELISA substrates をご参照下さい。

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【07】 OD を測定するのにどのフィルターを使用するべきですか?

基質の製造元の指示に従って下さい。pNPP の場合、通常 405nm で、TMB の場合は450nm で分析します。570 -650nm の間のリファレンス波長を引くことのできるリーダーをお奨めします。2波長を使用することで、両方の波長で光を等しく吸収し、塵などによる乱れを軽減します。

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【08】 なぜ、製品添付書に記載されているスタンダードカーブと自身のアッセイでのスタンダードカーブが異なるのですか?

ELISA デベロプメントキットの添付書に掲載されているスタンダードカーブは、マブテック社でのテストによる典型的なグラフです。このキットには、プレート、バッファー、基質が含まれていないため、これらの選択がアッセイ結果に影響を与え、予想から外れる場合があります。ELISApro キットのスタンダードカーブは、添付書で示されたものからそれほど外れるべきではありません。

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【09】 自身のサンプルの濃度を得るためにどのようにスタンダードカーブを用いれば良いですか?

基本的に、サンプルの吸収度の値がx軸で濃度と一致するので、サンプルの吸収度の値は、検量線に基づき、濃度に変換することができます。
ELISA analysis/How to determine sample concentration guidelines をご参照下さい。

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【10】 ネガティブコントロールのウェルで高いOD値を得ました。これを避けるにはどのようにしたらよいですか?

ネガティブコントロールのシグナルは、アッセイにおける非特異的結合を示します。これは通常、プレートの洗浄と無関係なタンパク質による結合部位のブロッキングを行うことで、避けることができます。もし血清・血漿サンプルを分析している場合、異好性抗体による干渉はELISA希釈液及びアッセイバッファーを使用することで軽減することが可能です。(Q02, Q03 をご参照下さい。)
ELISA analysis/Reducing unspecific signal をご参照下さい。

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【11】 細胞培養上清のIL-4 の ELISA ではネガティブでしたが、細胞をテストしたところ、IL-4 ELISpot でスポットが観察されました。

ELISpot は、一般的にELISA よりも感度が良く、ELISA では検出困難なサイトカインでも、ELISpot では簡単に検出されます。この現象は、細胞によるIL-4 の速い消費により細胞培養上清にIL-4 がとても低いレベルしか残らないことで説明されるかもしれません。ELISpot において、IL-4 は、コートされた抗体に直ちに捕捉され、分泌後の細胞による消費は起こりにくくなります。加えて、可溶性のサイトカインレセプターによるサイトカインの消費(しばしば細胞内の活性化の結果として誘導される) は、サイトカインを拘束することになり、ELISA においてその結合を妨げている可能性があります。分泌したときに直接サイトカインを捕捉することで、ELISpotではこれらの効果を最小限に抑えます。IL-4、IL-21 やTNF- αなどのサイトカインはこのような傾向を示しますが、程度は違いますがおそらく大部分のサイトカインがこのような傾向にあります。

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