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Q&A

記事ID : 11692

FAQ : 101 Bio(OBL)社 エクソソーム単離用PureExo®キットについて

キットの選び方について

キットの使用方法について

キットの選び方について

【01】 本キットで、培養上清から大きいエクソソーム様の小胞(最大直径1000nm)を単離/精製することはできますか?

できません。本キットでは、直径が300nm以上の小胞は単離できません。

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【02】 品番P101のキットを血漿に使用することはできますか?

血漿と血清の両方にご使用いただけます。

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【03】 品番P101のキットで処理できる血清サンプルの必要最低量は?

必要最低量は 50μLです。100 μL 〜 400 μL の血清/血漿をご使用いただくことを推奨します。

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【04】 本キットで、培養細胞から、エクソソームや内皮微粒子を単離できますか?

品番P100のキットは、細胞培養上清からエクソソームを単離するために使用するキットです。細胞から微粒子を単離することはできません。

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【05】 本キットで精製したエクソソームには、IgG やビーズが混入していますか?

本キットは、単離に抗体やビーズを使用しないため、最終的に単離されたエクソソームに人工的に作製した IgG やビーズが混入することはありません。

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【06】 本キットで精製したエクソソームには、アルブミンが含まれていますか?

細胞や血清サンプルの種類によっては、アルブミンが含まれる場合があります。例えば、肝細胞ではアルブミンが産生され、肝臓由来のエクソソーム(アルブミンを含む)が循環系に放出される可能性があります。

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【07】 品番P100のキットを、アメーバ状のキイロタマホコリカビ(D.discoideum amoeba)に使用することはできますか?

本キットは、細胞から放出されたエクソソームや微小胞を捕捉します。アメーバのエクソソームを単離するには、細胞の場合と同様にアメーバの培養上清を回収し、本キットで精製することをお奨めします。

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【08】 最終的なエクソソームの調製液に含まれるバッファーはどのような組成ですか?精製したエクソソームを用いたアッセイに影響はありますか?

最終的に単離したエクソソームは、PBSに懸濁された凝集ナノ粒子で、元々の培養上清または血清がごく微量含まれています。RNA/タンパク質の抽出、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いたアッセイ、表面標識などの各種アッセイに、バッファーの影響を考慮せずにご使用いただくことができます。

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【09】 単離したエクソソームが高純度で、膜由来の微粒子(破砕された小胞)を含まないことをどうすれば確認できますか?

透過型電子顕微鏡(TEM)を用いたアッセイにより確認できます。本キットで細胞培養上清や血清から単離した微小胞は、電子顕微鏡による観察で、粒子を包む直径20-200nmの球状の膜であることがわかっています。これらの特徴から、回収した微小胞がエクソソームであると決定づけることができます。破砕された小胞は、直径が最大1000nmで、形が不規則であることが報告されています。また、動的光散乱によるサイズ分布パターン解析でも、単離した微小胞の直径が100から200nmの間にあることが示されています。

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【10】 単離されたエクソソームは機能的な活性をもっていますか?

本キットで単離したエクソソームに含まれる、特異的な microRNA(miRNA)の機能を検討しました。miRNAの標的mRNA 3'UTR領域を組み込んだレポーターベクターをトランスフェクションした細胞にエクソソームを添加し、その後ルシフェラーゼ活性アッセイにより、エクソソーム由来のmiRNAが機能的に活性であることを確認しています。

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キットの使用方法について

【11】 ガラスチューブを使う必要がありますか? ガラスチューブはどこのメーカーで扱っていますか?

ステップ3とステップ4では、プラスチックチューブの代わりにガラスチューブを使用する必要があります。

(推奨ガラスチューブ:Fisherbrand* Disposable Borosilicate Glass Tubes 品番14-961-26)
http://www.fishersci.com外部リンク

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【12】 中間層に明確な"fluff"が見えません。

次のような可能性が考えられます。

  1. 細胞培養上清や血清を加える前に、溶液A/B/Cが完全に混合されていなかった。
  2. 細胞や細胞破片を取り除くための低速遠心分離をしなかった。
  3. 混合比が間違っている。例えば、A液 0.125 mL + B液 0.125 mL + C液 0.5 mL、培養上清 2 mLのように、混合溶液(A/B/C)に対するサンプル(血清/培養上清)の割合が高すぎると、中間層が目立たなくなります。
  4. 培養上清の量は最大 4 mL、細胞数は 5×10^5 個以下にする必要があります。細胞数や培養上清の量がこれより多い場合は、サンプルを複数に分ける必要があります。
  5. FBS由来のエクソソームを除去する目的で、細胞を48時間以上飢餓状態に置くことは避けてください。
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【13】 単離したエクソソームの同定には、どのようなバイオマーカーを使用しますか?

Flotillin、CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101 などのエクソソームマーカーを使用します。

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【14】 精製したエクソソームを用いて qRT-PCR アッセイを行う際に、どんなキットを使用すればいいですか?

QIAGEN社 miScript II RT Kit(品番218160)、miScript SYBRR Green PCR Kit(品番218073)を推奨します。

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【15】 エクソソーム由来RNAのRT-PCRアッセイにお奨めの内在性コントロールはありますか?

サンプルによって異なります。使用したエクソソームサンプルのコントロールとして適したリファレンス遺伝子を選択してください。下記にリファレンス遺伝子を示しますが、実験ごとに適切なコントロールを検証する必要があります。

cel-miR-39-3p
SNORD61
SNORD68
SNORD72

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【16】 エクソソームの収量はどのくらいですか?

  • 品番P100(PureExo® キット - 細胞培養上清用)
    2 mL の細胞培養上清から、通常 50〜100 uL のエクソソームを単離できます(1回の反応で最大 4 mL の培養上清を処理できます)。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 2mL の培養上清から150〜200 μg、4 mL の培養上清から300〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 2mL の培養上清から 50〜100 ng、4mL の培養上清から 100〜200 ng です。
  • 品番P101(PureExo® キット - 血清/血漿用)
    100 μL〜400 μL の血清から、通常 100〜200 μL のエクソソーム(PBSに懸濁)を単離できます。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 300〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 200〜300 ng です。
  • 品番P120(DiagExo® キット、尿用)
    3 mL の尿から、通常 50〜200 μL のエクソソームを単離できます。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 150〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 50〜200 ng です。
品番 品名 サンプル 推奨サンプル量 予想される収量
エクソソーム(in PBS) エクソソーム由来のタンパク質 エクソソーム由来のRNA
P100 PureExo® エクソソーム単離キット
細胞培養上清用
細胞培養上清 2〜4 mL 50〜200 μL 150〜400 μg 50〜200 ng
P101 PureExo® エクソソーム単離キット
血清/血漿用
血清 200 μL 100〜200 μL 300〜400 μg 200〜300 ng
P120 DiagExo® エクソソーム単離キット
尿用
尿 3 mL 50〜200 μL 150〜400 μg 50〜200 ng
P121 DiagExo® エクソソーム単離キット
ヒト体液用
生体液 0.1〜1 mL サンプルにより異なる サンプルにより異なる サンプルにより異なる
P200 エクソソームRNA/タンパク質抽出キット エクソソーム 50〜100 μL - 150〜200 μg 50〜100 ng
P300 エクソソームタンパク質抽出キット
血清用
血清 200 μL 100〜200 μL 300〜400 μg -
※エクソソーム由来のタンパク質/RNAの収量は、品番P200のキットを用いて試験しています。他のキットを使用する場合は、収量が低下する場合があります。
※各反応ごとの収量は、サンプルによって異なります。
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【17】 品番P101 のキットで血漿からエクソソームを単離する際に、ヘパリン/EDTAチューブを用いて血液サンプルを採取することはできますか?

できません。ヘパリンは、エクソソーム精製後のRNAアッセイに有意に影響します。EDTAは、エクソソーム精製後のPCRアッセイに影響を与える場合があります。血液サンプルの採取には、ヘパリン/EDTAの含まれていないチューブを使用してください。血液サンプルを速やかに遠心し、エクソソームを単離するための血漿を回収します。抗凝固剤を使用する必要がある場合は、EDTAチューブを使用して血液を採取してください。必要に応じて、エクソソーム精製後のPCR反応の Mg2+ 濃度を調整します。

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