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Q&A

記事ID : 11812

FAQ : ORIGENE(ORG)社 microRNA(miRNA)発現プラスミドについて

【01】 miRNAクローンには何がクローンされていますか。

ORG社のmiRNAクローンには、pri-mir(60-70nt)とその両側に250-300ntの隣接するゲノム配列を付加したものが挿入してあります。

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【02】 どのようにしてmiRNAが発現しているか調べることができますか。

ORG社では、短鎖RNAを導入細胞より単離しています。その後、RT-PCRまたはqPCRを行いmiRNA発現レベルの発現を測定しています。

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【03】 miRNAクローンは全長配列決定をしてありますか。配列情報はどこに記載されていますか。

配列決定してあります。全miRNAクローンはシークエンシングを行い、pre-mir配列がmiRBaseのリファレンス配列と一致することを確認しています。隣接領域の配列は遺伝子多型等によりNCBIのリファレンス配列と完全一致しない場合があります。この点は、mature miRNA機能に関与しないと考えています。

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【04】 シークエンシングプライマー配列を教えてください。

挿入配列の5'側または3'側からのシークエンシングにはVP1.5: 5'- GGACTTTCCAAAATGTCG -3' (Tm=51℃), XL39: 5'-ATTAGGACAAGGCTG-¼GTGGG -3' (Tm=60℃)をお使い頂けます。何れのプラスミドもmiRNA発現クローンとともにご提供致します。ただし、これらのプライマーはTm値に差があるため、挿入配列増幅用としてはあまり機能しません。

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【05】 トランスフェクション効率はどのようにモニターすればよいですか。

ORG社ではトランスフェクション時にtGFPシグナルを確認しています。pCMV-mirベクターにはSV40プロモータにドライブされたIRES-tGFPレポータ遺伝子が組込まれており、ネオマイシン遺伝子の下流に位置しています。2種類の発現カセットの干渉を最小限に抑えるため、tGFPとpre-mirの発現は異なるプロモータにより個別に生ずるようデザインしてあり、tGFP発現はトランスフェクション効率を正確に反映します。

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【06】 miRNAプラスミドを用いて定常発現株を構築できますか。選択マーカーは何ですか。

構築できます。G418選択またはGFP発現細胞の選択により定常発現株を選択できます。

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【07】 各プラスミドからは1つのmiRNAのみが発現するのでしょうか。

その限りではありません。いくつかのmiRNA遺伝子(約10%)は染色体内の近接領域で群集しており、天然では同時に発現している可能性があります。ORG社のmiRNAクローンではこれらを分離していません。1つ以上のmiRNAを含むmiRNAクローンに関してはORG社ウェブサイトに記載しており、該当miRNAクローンにリンクしてあります。

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【08】 miRNAベクターはどのようにして検証してありますか。

ORG社のmiRNAは全てmiRBaseのリファレンス配列と一致します。miRNAクローンの隣接配列は、遺伝子多型等の理由によりNCBIのリファレンス配列とは異なる場合があります。

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【09】 miRNA発現プラスミドのコントロールは何ですか。

ORG社ではmiRNA発現確認にはpCMV6-mirベクターをコントロールとして使用しています。

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【10】 miRNAプラスミドにコントロールは付属されていますか。

付属していません。pCMVMIRベクター(品番:PCMVMIR) を別途ご購入ください。

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【11】 論文発表に際し、本商品をどのように引用すればよいですか。

特定のカタログ番号を用いて商品を参照するとともに、製造元に関してはOriGene Technologies (Rockville, MD)とご記入ください。また、お客様の論文が公表された際には、ぜひコスモ・バイオ社までご連絡ください。ご連絡頂いたお客様にはORG社よりプレゼントをご用意しています。

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