- 【01】 本キットで提供されているポジティブコントロールは何ですか？
- 【02】 本キットの原理を教えてください。
- 【03】 ポジティブコントロールが適切に働いていないようです。原因は何でしょうか。
- 【04】 キットプロトコールで推奨している溶解バッファーの代わりに自分の溶解バッファーを使うことはできますか？
- 【05】 サンプル中のPKA濃度を測定できますか？
- 【06】 ヒト以外の種についても使用できますか？
- 【07】 スタンダードとサンプルを3重測定 (triplicate) した際、ウェル間でばらつきがみられました。値は範囲内でしたがばらついています。理由は何でしょうか。
- 【08】 プロトコールにはPKA酵素はポジティブコントロールとして提供されていると記載されています。スタンダードカーブを作製する際に用いることはできますか？
- 【09】 プレートにコートされている基質ペプチドはPKAに特異的ですか？
本キットは様々な種に由来する異なるサンプルタイプ (精製済み、部分的に精製済み、粗精製酵素) の相対PKAキナーゼ活性を定量します。基質であるペプチドがマイクロタイタープレートにコートされており、活性型PKA酵素とATPが存在するとペプチドはリン酸化されます。リン酸化特異的抗体、続いてHRP標識二次抗体、TMB基質を順次添加し、リン酸化ペプチドの定量を行います。生じた呈色強度を450nmで読み取りますが、強度はPKAリン酸基転移酵素活性に比例します。
タンパク質は注意深く扱わないとすぐに分解してしまいます。必ず-70℃で保存してください。また、1回以上に分けて使用する場合は、気を付けて分注操作を行ってください。
キットプロトコールで推奨しているバッファーは開発者により最適化されたものです。他のバッファーでも使えるかもしれませんが、テストされているものはプロトコールに記載してある溶解バッファーのみです。
ウェル間のばらつきは、混合不足の可能性があります。プロトコールに示されている通り、穏やかに混合してください。
キットで提供されている活性PKAキナーゼはポジティブコントロールであり、スタンダードカーブ作成用酵素ではありません。PKAの濃度はロット間で異なり、濃度情報はバイアルのラベルに記載されています。この濃度はポジティブコントロールの滴定を計測するために使用します。滴定を行うことで、活性キナーゼが飽和状態になる時点を教えてくれます。コントロール酵素は構成品の残りが働いているか、そして残りのアッセイについて最適なパラメータを確立することを助けます。
