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Q&A : GMbiolab社 植物トータル RNA ミニプレップ精製キットのトラブルシューティング

商品詳細:

■ スピンフィルターが詰まる
問題点 解決方法
a) サンプル量が多すぎる サンプルの量を減らし(< 100 mg)、植物組織が十分に破砕されていることを確認してください。
b) デンプンを含むサンプルを 60℃ で加熱した デンプンを含む植物組織(ポテト塊茎、トウモロコシ種子など)は、溶解溶液を加えた後、60℃ ではなく室温でインキュベートしてください。
c) 脂質を多く含む植物組織 遠心の時間を5分まで延長し、細胞破片を沈殿させてください。
浮遊している脂質をピペッティングしないようにしてください。
■ スピンカラムが詰まる
問題点 解決方法
a) 組織が多すぎる 必ず正確な量の組織を使用してください。
b) エタノールを加える前に遠心しなかった エタノールを加える前に、ライセートを遠心してください。
細胞破片を含むペレットは、RNA スピンカラムが詰まる原因になります。
■ RNA の収率が低い
問題点 解決方法
a) 組織が多すぎる 組織の量は 100 mg を超えないようにしてください。
抽出が非常に困難な植物組織(かんきつ類の葉やレッドメープルの葉など)は、50 mg からスタートしてください。
抽出が困難な植物で 100 mg 以上、非常に困難な植物で 50 mg 以上の組織を使用すると、RNA の収率が大幅に低下し、ほとんど回収できない場合もあります。
b) サンプルに含まれるトータル RNA 量が少ない 植物の種類によって、収率は大きく異なります。
c) 植物組織の破砕が不十分 植物組織を液体窒素中で微粉末に粉砕してください。
RNA の収率を向上させるには、抽出の前に組織がどの程度粉砕されているかが重要となります。
d) RNA がまだ膜に結合している カラムにヌクレアーゼフリー水を加え、室温で10分間インキュベートした後に遠心し、再度溶出を行ってください。
■ RNA の分解
問題点 解決方法
a) RNase の混入
  1. RNase フリーの溶液・ピペットチップ・プラスチック/ガラス製品を使用してください。
  2. RNase DNase Away Solution(品番: D0339-100/D0339-500)で実験室を拭いてください。
  3. 手袋を頻繁に交換してください。
b) 溶解から回収までのサンプルの取扱いが不適切
  1. フレッシュな植物組織を、-70℃ または液体窒素で瞬間凍結(Snap-freeze)してから、保存してください。
  2. 凍結サンプルは、RNA Lysis/2-ME 溶液を添加するまで、凍ったまましてください。
  3. 組織を RNAfter™ (RNA Stabilization Solution for Tissue; 品番: RA-100)中で保存してください。
■ DNA の混入
問題点 解決方法
a) DNase I 処理していない 2 μL の DNase I を必ず加えて下さい。
(DNase I インキュベーションバッファーと一緒にキットに付属)
b) RNA 洗浄溶液 I でインキュベーションしていない 調製の際、RNA 洗浄溶液 I を RNA スピンカラムに加え、室温で15分インキュベートしてから遠心してください。
■ 抽出した RNA を使用した以降の実験が成功しない
問題点 解決方法
a) エタノールのキャリーオーバー メンブレンをトップスピードで3分間遠心し、完全に乾燥させてください。
遠心後、RNA スピンカラムを 45〜60℃ の乾燥器で5分間インキュベートし、残留したエタノールを全て蒸発させてください。
b) 溶出液に塩が残留している チオシアン酸グアニジンが残留していると、酵素活性が阻害されます。
RNA 洗浄溶液 II を加える前に、RNA スピンカラムを新しい 1.5 mL マイクロチューブに移し変えてください。