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Q&A : GMbiolab社 プラスミド精製キットのトラブルシューティング

GMbiolab(GMB)社 プラスミド精製キット
商品詳細:

 
■ 収量が少ない/全くない
問題点 解決方法
プラスミドが増幅しなかった 新しく作製したプレートからシングルコロニーの菌体をピックアップし、推奨の抗生物質を含む液体培地を使用して、適切な条件下で培養してください。
菌体が増えすぎた 菌体が増殖しすぎると、菌体細胞の溶解 および DNA の分解が起こります。12〜16時間を超えて培養することは避けてください。
菌体数が十分でない 推奨温度で一晩振とう培養し、最適な密度に増殖させてください(OD600 > 1)。
サンプル量が多く、カラムが目詰まりする スピンカラムの目詰まりを防止するために、推奨量以上のサンプルを使用しないでください。
低コピー数プラスミド 低コピー数プラスミドを使用する場合は、培養液量を増やしてください。低コピー数プラスミドの収量は、培養液量を増やしても、高コピー数プラスミドより少なくなります。
細胞の溶解が不完全
  • 菌体が増えすぎた
    培地に適切な抗生物質を加える必要があります。
  • 細胞の懸濁が不十分
    溶液 II を加える前に、ボルテックスまたはピペッティングにより、細菌ペレットを完全に再懸濁してください。
DNA の溶出が不完全
  • プラスミドが 7Kb 以上の場合は、溶出の際に、予熱した溶出液(60〜70℃)を使用してください。
  • DNA の溶出には、低塩濃度バッファーを使用してください[例: 溶出液(10 mM Tris·Cl、pH 8.5)または精製水]。溶出効率は pH に依存します。最大効率は pH 7.0〜8.5 の間で得られます。溶出に精製水を使用する場合は、pH値がこの範囲内であることを確認してください。
  • 溶出液をメンブレンの中央に加え、完全に吸収されていることを確認してください。
■ ゲノム DNA の混入
問題点 解決方法
菌体が増えすぎた 菌体が増殖しすぎると、菌体細胞の溶解 および DNA の分解が起こります。12〜16時間を超えて培養することは避けてください。
ライセートの調製が適切でない
  • ゲノム DNA のせん断を防ぐために、ライセートに溶液 II を加えた後は、優しく扱ってください。
  • 溶解ステップは、5分を超えないようにしてください。
溶液 III の添加が不適切 溶液 III を添加したらすぐに、優しく混合してください。
■ RNA の混入
問題点 解決方法
RNase A の消化が不十分
  • 使用する前に、溶液 I に RNase A を添加し、4℃に保管してください。
  • RNase A を添加した溶液 I を一年以上保管している場合は、溶液 I に RNase A を追加します。
  • 必要に応じて、培養液量を減らします。