FAQ：Invivogen（ING）社 選択用抗生物質について

任意の選択用抗生物質を同時に、任意の組み合わせで使用できます。

細胞培養の初期段階では細胞が壊れやすく、抗生物質が細胞の生存率を低下させる可能性があるため、細胞が 2 回継代されるまでは抗生物質を添加しないことをお勧めします。細胞が抗生物質に対する耐性を獲得するには、耐性マーカーが十分に発現されている必要があります。

Invivogen社の選択用抗生物質 (Zeocin®、Hygromycin、 G418、 Phleomycin、 PuromycinおよびBlasticidin) を不活化するには、増殖培地に以下を添加することをお勧めします。
- 5% NaOH (水酸化ナトリウム)
- 0.1% NaClO (次亜塩素酸ナトリウム)
その後、5 〜 10 分間反応させる必要があります。これにより培地中のすべての抗生物質が効果的に不活性化されます。

残念ながら、細胞培養培地中の選択的抗生物質の半減期に関するデータはありません。Invivogen社内では選択用抗生物質を即座に添加することが多いですが、必要に応じて培地に抗生物質を補充し、4 ℃で 1 週間以内であれば保管することができます。

高塩分の LB 培地条件では、Hygromycin B Goldを 100 〜 150 µg/mL の濃度で使用することをお勧めします。

哺乳動物細胞株に対するHygromycin B Goldの使用濃度は 50 〜 200 µg/mL ですが、場合によっては、最大 500 µg/mL まで使用可能です。
最初の実験では、宿主細胞株を死滅させるのに必要となるHygromycin B Goldの最適濃度を決定することをお勧めします。一般的に、Hygromycin B Goldは、ストック溶液の500倍希釈である200µg/mL の濃度で使用します。詳細にについては、本製品のTDS（製品データシート）をご参照ください。

Hygromycin耐性を持つ形質転換体は、50〜100µg/mL のHygromycin B Goldを添加した低塩LB寒天培地(酵母エキス5 g/L、トリプトン 10g/L、NaCl 5g/L、アガー 15g/L、pH 8)で選択されます。
Hygromycin B Goldを含むプレートは4℃で保存した場合、1ヶ月間安定します。

当社が供給するZeocin®は塩酸です

いいえ、Zeocin®に感光性はありません。

Zeocin®は高 pH および低 pH [6 〜 8]、または弱い酸化剤の存在下では不可逆的な変性を受けます。

滅菌水で希釈してください。

Zeocin®粉末の再構成に使用される HEPES バッファーの濃度は 5 g/L です。

哺乳動物細胞株におけるZeocin®の使用濃度は 50 〜 400 µg/mL ですが、場合によっては20 〜 1000µg/mL になります。最初の実験では、宿主細胞株を死滅させるのに必要なZeocin®の最適濃度を決定することをお勧めします。
詳細については、本製品のTDS（製品データシート）を参照してください。

Zeocin®耐性を持つ形質転換体は、25µg/mL のZeocin®を添加した低塩LB寒天（酵母エキス 5 g/L、トリプトン 10 g/L、NaCl 5 g/L、アガー 15 g/L、pH 7.5）で選択されます。
注意：Tn5 転移因子を含む大腸菌レシピエント株（MC1066など）を使用しないでください。Tn5はブレオマイシン耐性遺伝子をコードし、Zeocin®に対する耐性を与えます。

哺乳動物細胞株におけるPhleomycinの使用濃度は5 〜 50 µg/ml です。最初の実験では、宿主細胞株を死滅させるのに必要なPhleomycinの最適濃度を決定することをお勧めします。
詳細については、この製品のTDS（製品データシート）を参照してください。

Sh bleやTn5などのbleomycin耐性遺伝子を保有するベクターによって形質転換された大腸菌レシピエント株（例えばHB101, DH5α, MC1061）はPhleomycinに耐性を持っています。
Phleomycin耐性を持つ形質転換体は、５µg/mLのPhleomycinを添加した低塩LB培地（酵母エキス 5 g/L、トリプトン 10 g/L、NaCl 5 g/L、アガー 15 g/L、pH 7.5）で選択されます。

社内でも同様の現象が観察されています。理由として、0 ℃未満でも溶液の凍結反応は自然に始まらない点が挙げられます。凍結反応が始まるには振動や衝撃などの攪乱が必要です。ただし液体中で凝固が起こるとすぐに連鎖反応が起きて、溶液全体に急速に伝播する点に注意してください。
Invivogen社の研究員によると、G418のチューブ間でしばしば固化の違いが観察されますが、これはあるチューブに小さな衝撃が加わり、他のチューブには衝撃が加わらなかったためと説明されています。

neo遺伝子を導入した哺乳類細胞株を選択・維持するために必要なG418硫酸塩の濃度は、細胞の種類など多くの要因によって異なります。
最初の実験では、100 µg/mL から 1 mg/mL までの濃度で細胞を処理し、宿主細胞株を死滅させるのに必要な抗生物質の最適濃度を決定してください。 注：G418 は通常 400 µg/mL の濃度で使用されます。

いいえ。 G418 は、Neo 遺伝子を発現する哺乳動物細胞を選択するために使用されます。 Neo 遺伝子を発現する大腸菌の選択に適切な抗生物質はカナマイシンです。

保存中にPuromycinの結晶沈殿が形成される場合があります。このような場合は、結晶沈殿が消えるまで 37 ℃ で 30 分間加熱してください。結晶沈殿物の形成は製品の活性には影響しません。

哺乳動物細胞株におけるPuromycinの使用濃度は 1 〜 10 µg/mL です。最初の実験では、宿主細胞株を死滅させるのに必要なPuromycinの最適濃度を決定することをお勧めします。Puromycinは、pac遺伝子を含まない真核細胞を迅速に死滅させます。
詳細については、この製品のTDS（製品データシート）を参照してください。

Puromycinは大腸菌に対してはあまり活性がありません。しかし、Puromycin耐性を持つ形質転換体は、100〜125µg/mlのPuromycinを添加したLB寒天培地[pH7.5〜8]で選択することができます。

哺乳動物細胞株におけるBlasticidinの使用濃度は1 〜 10 µg/mL ですが、場合によっては最大30 µg/mLまで使用可能です。最初の実験では、宿主細胞を死滅させるのに必要なBlasticidinの最適濃度を決定することをお勧めします。
詳細については、この製品のTDS（製品データシート）を参照してください。

大腸菌はBlasticidinに対する感受性が低いですが、Blasticidin耐性を持つ形質転換体は、100µg/mLのBlasticidinを添加した低塩LB寒天培地(pH8)で選択することができます。高 pH はBlasticidinの活性を高めます。