FAQ : Alomone Labs（ALO）社　ウェスタンブロットのトラブルシューティング

Alomone社のすべての抗体は、ウェスタンブロッティングによる厳格なQC分析を受けています。各ロットをアフィニティカラムで精製し、分析は同じプロトコル、同じ条件で行っています。

また、前回のロットと比較して満足のいく結果が得られてから抗体をリリースしています。シグナルが得られない場合は、根本的な問題がある可能性があります。

• 一次抗体や二次抗体の使用量が不足している可能性があります。抗体の推奨希釈率に従うか、または異なる抗体希釈倍率をテストして最適な抗体濃度を決定してください。
• 二次抗体が一次抗体に作用していない可能性があります。二次抗体が、一次抗体の免疫動物に対するものであることをご確認ください。
• 洗浄バッファーや二次抗体溶液に含まれるNaN₃ (アジ化ナトリウム)が問題となる場合があります。
• 目的のタンパク質がサンプル中に存在しないか、または存在している量が非常に少ない可能性があります。
• 一次抗体が対象となる生物種のタンパク質を認識していない場合もあります。抗体のデータシートを確認し、ご使用の生物種と交差反応するかどうかを確認ください。
• より多くのタンパク質をゲルにアプライするか、別のタンパク質抽出法によるサンプル調製を検討ください。標的タンパク質に最適なサンプル調製法は、対照となるハウスキーピングタンパク質 (GAPDHなど) に適用するものとは必ずしも一致しないことにご注意ください。

製品のデータシートに記載されている予想分子量（MW）は、ターゲットタンパク質のアミノ酸配列のサイズのみに基づいています。ウェスタンブロットのバンディングパターンには、以下のような多くの要因が影響することを忘れてはなりません。(1) スプライスバリアントの存在、(2) ロードされたサンプルの品質、(3) タンパク質の抽出方法、(4) タンパク質の転写条件。

正確な結果を得るためには、タンパク質の抽出方法やタンパク質の転送条件を体系的に調整する必要があります。

• バンドのMWが期待されるMWより低い場合、MWが若干異なるスプライスバリアントの可能性や、標的タンパク質がタンパク質分解により切断されてMWの低いバンドが生じた可能性があります。タンパク質の抽出方法や転写条件を変更することで、この問題を解決できるかもしれません。また、以下を試してみてはいかがでしょうか。
  • サンプルを70℃で10分間加熱する（100℃で5分間ではなく）と、分解の可能性が減る。
  • 転写時間を長くする。これにより、高分子量タンパク質の転写効率が向上します。この場合、4℃で20時間、100mAを推奨しています。
• いずれの場合でも、ネガティブコントロールとしてブロッキングペプチドを使用する必要があります。このペプチドは、免疫に使用された抗原であり、抗体を特異的にブロックします。(Alomone社の全ての抗体について、対応するブロッキングペプチドを販売しております)
  ブロッキングペプチドの使用法（ウェスタンブロット）こちらもご覧ください。

バックグラウンドレベルが高いのは、次のような原因が考えられます。(1)一次抗体の濃度が最適でない、(2)メンブレンの種類が適切でない、(3)ブロッキング条件が適切でない、(4)抗体とブロッキング試薬の間の非特異的結合、などです。

• 一次抗体を最適な濃度で希釈してください。ほとんどの場合 (Alomone社の抗体では) 1:200を推奨しておりますします。
• ニトロセルロース膜への変更を検討してみてはいかがでしょうか。PVDFメンブレンと比較して、ニトロセルロースメンブレンはバックグラウンドノイズが少ない傾向があります (検出感度は若干低くなります)。
• ウエスタンブロット中にメンブレンが乾燥しないようにしてください。
• 十分な時間ブロッキングをしていないと、多くのバックグラウンドが発生してしまいます。1-3%のウシ血清アルブミン（BSA）で1時間を推奨しますが、4℃で一晩でも問題ございません。
• 一次抗体溶液および洗浄バッファーに0.1%-0.5%のTween-20を加えると、シグナルが強くなり、非特異的な染色が減少する場合がございますのでお試しください。

通常、バンド数が多すぎる場合は、サンプルの前処理方法が最適でなかったか、またはサンプルの前処理中にターゲットタンパク質が分解されたことを示します。

• カルシウムチャネルのような膜貫通型タンパク質は、一般的にサンプル調製中に分解されやすいです。最適なサンプル調製法は、組織（脳、副腎など）や生物種（マウス、ヒトなど）によって異なる為、異なるプロトコールで調製したサンプルを並行して測定し、最適なサンプル調製法を確立することを推奨しています。なお、目的のタンパク質に最適なサンプル調製法は、コントロールとなるハウスキーピングタンパク質（GAPDHなど）に使用する方法とは必ずしも同じではありません。
• 高分子量のタンパク質を分析する場合は、SDS-PAGEの条件や転写条件を調整する必要があるかもしれません。
• 追加のバンドは、標的タンパク質のスプライシングバリアントまたはトランケートバージョンがあることを示している場合もあります。
• 一次抗体の濃度をより希釈したり、一次抗体溶液に0.5% Tween-20を添加することで改善される場合もあります。

ブロッキングペプチドの使用法（ウェスタンブロット）こちらをご覧ください。Alomone社の全ての抗体について、対応するブロッキングペプチドを販売しております。

曲がったバンド（「スマイリングバンド」と呼ばれることもあります）は、電圧が高すぎてタンパク質の移動が速くなったことが原因と考えられます。また、スマイリングバンドは、温度が高すぎる場合にも起こります。電圧を下げ、冷房の効いた部屋で泳動を行ってください。