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記事ID : 16708
研究用

クロマチン免疫沈降に向けたクロマチンサンプル調製

ChIP用キット「楽ちっぷキット」&超音波破砕装置「バイオラプターII」使用例


クロマチン免疫沈降用キット「楽ちっぷキット」と超音波破砕装置バイオラプターIIを使用し、培養細胞からのクロマチン分画の調製から、クロマチン断片化までを実施しました。

bioruptor_gelimage.jpg

 

  レーン1〜3 レーン4〜7
細胞 イヌ乳腺由来がん細胞 HEK293細胞
使用チューブ PP製 1.5 mLチューブ TPX製 1.5mLチューブ
超音波サイクル数
(1サイクル=30秒 ON/30秒 OFF)
8サイクル 12サイクル
同時処理本数 3本(n=3) 4本(n=4)
チューブ配置 12本掛けアクセサリーに均等配置(ダミーチューブ無し)
使用機種 Bioruptor II Type12

試料ご提供:
東京農工大学大学院 農学研究院
動物生命科学部門 獣医解剖学研究室
金田 正弘 先生

 

クロマチンサンプル調製

  1. 細胞培養液 10 mL(100 mm ディッシュで106オーダーの細胞数)に対し4%パラフォルムアルデヒド溶液3.3 mL(最終濃度が1%になる)を加え(即ちディッシュ上の細胞に直接添加)、室温で5分間静置。
  2. 2 ml のQuenching Solution を加え、室温で5分間静置。
  3. 溶液を十分に除去し、Cell Washing Solution 5 ml を加えてすすぐ。
    1 ml のCell Washing Solution を用いて細胞を回収し、遠心して上清を除去する。
  4. 溶液を除去しProtease Inhibitor を1/100量加えたCytoplasmic Lysis Buffer 1 ml を加え、細胞を集めて1.5 ml チューブに集める。
  5. 良くピペッティングして細胞を分散させた後4℃、5000 rpm で1分間遠心する。
  6. 上清を捨て、沈殿にProtease Inhibitor を1/100量加えたChromatin Lysis Buffer 200 μl を加えて10回程度ピペッティングする。
  7. 超音波破砕装置バイオラプターIIでクロマチンを分断する。
  8. 専用冷水循環機にて4℃に冷却しながら、30" ON, 30" OFF で8(レーン4〜7では12)サイクル行う。
  9. 8.では数サイクルおきにアクセサリーごとチューブを手でスピンダウンし、チューブ内壁に付着した液をチューブ底に集める。
  10. 15,000 rpm、4℃で10分間遠心。
    上清を回収し、800 μl(Lysis buffer の4倍量)のChIP dilution buffer を加え良く混合し、これをクロマチンサンプルとする。
  11. クロマチンサンプルを65℃ 6時間以上脱クロスリンク処理。
  12. クロマチンサンプル 100 μl あたり、2 μl のProteinase K およびRNase A を添加し65℃ 15分間反応させる。
  13. DNAをスピンカラムにより精製し、2%アガロースゲルにて電気泳動。

太字の試薬が「楽ちっぷキット」の構成品になります。

使用製品

楽ちっぷキット
株式会社モノクローナル抗体研究所
クロマチン免疫沈降(ChIP)用試薬キット
「楽ちっぷキット」

Bioruptor II Type12
ソニック・バイオ株式会社
密閉式超音波破砕装置
バイオラプターII

 

TOS_BIORUPTOR-accesory_7.jpg
ソニック・バイオ株式会社
バイオラプターII用アクセサリー
1.5mLチューブ用(最大12本掛け)
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。